Endocitosis

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 5524 (2022) Citar este artículo

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Se cree ampliamente que la transferencia horizontal de genes en bacterias ocurre mediante conjugación, transducción y transformación. Estos mecanismos facilitan el paso del ADN a través de la pared celular protectora mediante maquinaria sofisticada. Aquí, informamos que las bacterias con deficiencia de pared celular pueden fagocitar ADN y otro material extracelular mediante un proceso similar a la endocitosis. Específicamente, mostramos que las formas L del actinomiceto filamentoso Kitasatospora viridifaciens pueden absorber ADN plasmídico, polisacáridos (dextrano) y nanopartículas lipídicas de 150 nm. El proceso implica la invaginación de la membrana citoplasmática, lo que lleva a la formación de vesículas intracelulares que encapsulan el material extracelular. La absorción de ADN no se ve afectada por la eliminación de genes homólogos a comEC y comEA, que son necesarios para la transformación natural en otras especies. Sin embargo, la absorción es inhibida por la azida sódica o la incubación a 4 °C, lo que sugiere que el proceso depende de la energía. Los materiales encapsulados se liberan al citoplasma tras la degradación de la membrana de la vesícula. Dado que las bacterias con deficiencia de pared celular se consideran un modelo para las primeras formas de vida, nuestro trabajo revela un posible mecanismo para que las células primordiales adquieran alimento o material genético antes de la invención de la pared celular bacteriana.

Las bacterias están constantemente expuestas a condiciones ambientales cambiantes y dependen de su envoltura celular para protegerse. La envoltura celular consta de una membrana celular y una pared celular para separar el ambiente interno del externo. La membrana celular es una bicapa de fosfolípidos que encierra el citoplasma y funciona como una barrera selectiva. La pared celular consta de una capa gruesa de peptidoglicano (PG) para las bacterias Gram positivas y una capa más delgada de PG rodeada por una membrana externa para las bacterias Gram negativas. La capa de peptidoglicano es una importante estructura similar a una malla que no sólo proporciona protección contra el estrés mecánico y la presión de turgencia, sino que también define la forma y la rigidez de las células.

Para facilitar el paso selectivo de macromoléculas a través de la envoltura celular, las bacterias han desarrollado sistemas de transporte sofisticados y especializados1. Por ejemplo, las bacterias naturalmente transformables dependen de complejos proteicos para la captación de ADN, con componentes similares a los pili tipo IV o los sistemas de secreción tipo II. El transporte activo de ADN a través de la pared celular se ve facilitado por la retracción de las estructuras del pilus que se unen al ADN2,3. Luego se utilizan proteínas de unión al ADN y formadoras de poros para translocar el ADN a través de la membrana celular.

Aunque la pared celular es una estructura vital para la mayoría de las bacterias, algunas bacterias carecen naturalmente de pared celular o pueden desprenderse de ella en condiciones específicas. Los ejemplos incluyen los miembros de Mollicutes, que son parásitos y viven en ambientes osmóticamente protectores específicos, como las superficies mucosas humanas o los tubos cribosos del floema de las plantas4. La exposición prolongada a factores estresantes ambientales, como agentes dirigidos a la pared celular, genera las llamadas formas L, que son células que pueden proliferar sin sus paredes celulares. La reproducción de las formas L es independiente de la maquinaria de división canónica basada en FtsZ5 y está impulsada por un desequilibrio en la relación entre el área de superficie y el volumen de las células causado por la regulación positiva de la síntesis de membrana que conduce a la formación de ampollas, tabulación y vesiculación espontáneas6,7. Estas características celulares primitivas hacen de las formas L un sistema modelo atractivo para estudiar la evolución de la vida temprana8,9.

Algunos actinomicetos filamentosos, como Kitasatospora viridifaciens, formador de micelio, tienen la capacidad de desprenderse transitoriamente de su pared celular en condiciones de estrés hiperosmótico (Fig. 1a)7. A diferencia de las formas L, las células S no pueden proliferar sin su pared celular, aunque estas células pueden volver al modo de crecimiento micelial después de reconstruir su pared celular. Las células con deficiencia temporal de pared celular también se pueden generar artificialmente a partir de bacterias con pared celular mediante la eliminación enzimática de la pared celular, por ejemplo, mediante la acción de la lisozima que degrada el peptidoglicano. Esto conduce a la formación de protoplastos o esferoplastos, que se utilizan ampliamente con fines de ingeniería genética, lo que a menudo implica el uso de polietilenglicol (PEG) para permitir la entrada del ADN en la célula10. Aunque esta transformación basada en PEG es una técnica ampliamente utilizada para la transformación de actinomicetos filamentosos, nunca se ha demostrado de manera inequívoca si las células con pared de K. viridifaciens, o sus células con pared celular natural deficiente, son capaces de realizar una transformación genética natural sin usar PEG. Se desconoce cómo la ausencia de pared celular afecta la absorción natural de macromoléculas como el ADN del medio ambiente.

a Representación esquemática de la generación de células con deficiencia de pared celular de K. viridifaciens. Las células con deficiencia temporal de pared incluyen protoplastos, obtenidos a partir de células miceliares por la acción de la lisozima, y células S, extruidas de las puntas de las hifas en un medio con alta presión osmótica. Las formas L con deficiencia permanente de pared se generan después de una incubación prolongada del micelio bajo una presión osmótica alta (línea M1), con la suplementación opcional de lisozima (Lys) y penicilina G (PenG) (líneas alfa y delta). b Micelio (n = 3), protoplastos (n = 5 de dos experimentos), células S (n = 7 de dos experimentos) y líneas alfa en forma L (n = 3 para células de 4 y 6 días ), delta (n = 2 para células de 3 y 7 días) y M1 (n = 1 para células de 3 días) se incubaron con ADN plasmídico (pRed*) durante 18 a 24 h, se sembraron en medio selectivo y se incubó a 30 ° C para seleccionar las células transformadas. Se ofrece un primer plano de la morfología de las colonias de las formas L. Las barras de escala indican 1 mm. Tenga en cuenta que sólo las formas L muestran una absorción constante de ADN. c Eficiencia de transformación basada en polietilenglicol (PEG) de micelio, protoplastos, células S y formas L de K. viridifaciens utilizando ADN plasmídico (pRed*) como se indica en el porcentaje de colonias transformadas. n = 3 réplicas biológicas excepto células S (n = 4). d Eficiencia de transformación de alfa y alfaΔcomEA/EC de 7 días después de una incubación de 24 h con pFL-ssgB. UFC = unidades formadoras de colonias. ns = no significativo (n = 5 réplicas biológicas, prueba t independiente bilateral, t(8)=1,572, P = 0,155). e Eficiencia de transformación de alfa de 1, 3 y 7 días después de 24 h de incubación con pFL-ssgB. Los asteriscos (**) indican P ≤ 0,01 (n = 4 réplicas biológicas, ANOVA unidireccional, F (2, 9) = 12,16, prueba post hoc de Tukey, P = 0,006 (1–3 días) y 0,005 (1–7 día)). f Eficiencia de transformación de alfa de 7 días incubado con pRed* durante 6, 24 o 48 h. El asterisco (*) indica una diferencia estadísticamente significativa entre la incubación de 6 y 24 h (prueba de Kruskal-Wallis bilateral, H(2) = 8,769, P = 0,012 con la prueba de pares de Dunn, incluida la corrección de Bonferroni, da P = 0,010 para 6 y 24 h, P = 0,233 para 6 y 48 h y P = 0,718 para 24 y 48 h). ns no significativo. n = 4 réplicas biológicas. g Polarización generalizada (GP) como medida de la fluidez de la membrana de alfa de 1, 3 y 7 días utilizando el tinte de membrana Laurdan. Un GP más bajo indica una mayor fluidez de la membrana. n = 3 réplicas biológicas. Los datos en (c – g) se representan como media ± DE con puntos de datos individuales. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En este trabajo mostramos que las formas L del actinomiceto filamentoso K. viridifaciens pueden absorber ADN independientemente de la maquinaria de transformación genética natural canónica. En cambio, la absorción se ve facilitada por un mecanismo de transferencia horizontal de genes que implica la invaginación de la membrana celular que conduce a la formación de vesículas internas. Además, demostramos que este mecanismo es robusto y permite también la absorción no específica de otras macromoléculas del medio ambiente. Dado que las formas L se consideran un modelo de vida celular temprana, nuestro trabajo proporciona información sobre cómo células tan antiguas pueden haber adquirido grandes biomoléculas y nanopartículas del medio ambiente sin la necesidad de complejas maquinarias de transporte.

Se desconoce si las células con o sin pared de K. viridifaciens son capaces de realizar una transformación genética natural. Para analizar esto, se recolectaron recientemente células miceliales con paredes, protoplastos y células S sin paredes temporales y formas L (alfa) sin paredes permanentes y se resuspendieron en un medio LPB osmóticamente estable. Posteriormente, las células se incubaron durante 18 a 24 h con ADN plasmídico (pRed*) que contenía un casete de resistencia a antibióticos y se sembraron en medios selectivos y no selectivos para permitir la detección de células transformadas. En particular, las formas L pudieron absorber ADN de manera constante, a diferencia del micelio, los protoplastos y las células S (Fig. 1b). La absorción de ADN no se limitó a una línea de forma L, sino que se observó en distintas líneas celulares de forma L obtenidas de células con pared de K. viridifaciens cultivadas en medio LPB con (líneas alfa y delta) o sin (línea M1) penicilina y lisozima7. ,11. No se obtuvieron transformantes con alfa cuando se usó ADN genómico intacto o fragmentado, o cuando se usó plásmido metilado (Figuras complementarias 1a, b). Si bien la transformación genética natural estaba restringida a las formas L, todas las células con deficiencia de pared podían transformarse químicamente usando polietilenglicol (PEG), y los protoplastos, las células S y las formas L tenían una eficiencia de transformación promedio de entre 1,7 y 2,5 % (Fig. .1c). La adición de PEG también permitió la transformación de alfa con ADN genómico, incluso si estaba presente en un extracto celular crudo (Figura complementaria 1c). Por otro lado, el uso de ADN metilado impidió la transformación química, lo que indica que la transformación basada en PEG es posible con diferentes tipos de ADN, pero está limitada por la presencia de un patrón de metilación diferente. Por el contrario, las células amuralladas no pudieron transformarse con o sin PEG (Fig. 1b, c). Estos resultados muestran que, en estas condiciones, las formas L pueden captar ADN de forma natural, a diferencia de las células amuralladas, las células S y los protoplastos.

Las bacterias naturalmente transformables utilizan una maquinaria especializada de translocación de ADN con similitudes con los pili tipo IV o los sistemas de secreción tipo II para captar ADN externo2. Componentes similares de este sistema canónico también podrían estar involucrados en la captación de ADN por las formas L. Una búsqueda BlastP utilizando la proteína de unión al ADN ComEA y la proteína de canal ComEC de la bacteria naturalmente transformable Bacillus subtilis str. 168 contra K. viridifaciens produjo dos resultados significativos: BOQ63_029625 (proteína que contiene el dominio hélice-horquilla-hélice) y BOQ63_029630 (proteína de competencia familiar ComEC/Rec2), respectivamente (Tabla complementaria 1 y Fig. 1d complementaria). La ComFA helicasa/ADN translocasa de B. subtilis dio como resultado un impacto en un gen codificante putativo de Mfd (BOQ63_020315), una proteína bacteriana ampliamente conservada que media la reparación del ADN acoplada a la transcripción12. No se encontraron otros ortólogos que se correlacionaran con las proteínas involucradas en el transporte de ADN a través de la envoltura celular para B. subtilis, la Neisseria gonorrhoeae gramnegativa13 o para el sistema de captación de ADN relacionado con T4SS de Helicobacter pylori14 (Tabla complementaria 1). Las formas L carecen de una pared celular intacta basada en peptidoglicano y, por lo tanto, el ADN sólo debe cruzar la membrana celular para su internalización. En bacterias naturalmente transformables, ComEA y ComEC funcionan en el transporte de ADN a través de la membrana celular13,15,16. Aunque se desconoce el papel de los supuestos genes comEC y comEA en K. viridifaciens, ya que sus células amuralladas no mostraron captación de ADN, nos preguntamos si estas proteínas podrían estar involucradas en la captación de ADN en formas L. Por lo tanto, reemplazamos los supuestos genes comEC y comEA en la cepa alfa en forma L por un casete de resistencia a apramicina (Figura complementaria 1d, e). Sorprendentemente, la eliminación simultánea de los genes comEA y comEC no afectó la eficiencia de la transformación (prueba t independiente bilateral, t(8) = 1,572, P = 0,155), lo que indica que la captación de ADN por las formas L se produce independientemente de los genes. homólogo a esta maquinaria de translocación de ADN canónica (Fig. 1d).

La capacidad de captar ADN para la transformación natural se regula de manera diferente entre las bacterias transformables de forma natural y puede ser constitutivamente activa o restringida a una fase de crecimiento específica, como lo revisó Blokesch (2016)17. Uno de los factores que controla el desarrollo de la competencia para la captación de ADN en B. subtilis es la fase de crecimiento18,19. Para estudiar si la edad del cultivo también afecta la capacidad de absorción de ADN de las formas L, se sometieron células de cultivos de diferentes edades a un ensayo de transformación. Las células de cultivos de alfa de 1 día captan ADN más fácilmente que las de cultivos de 3 o 7 días (ANOVA unidireccional, F (2,9) = 12,16, prueba post hoc de Tukey, P = 0,006 y 0,005 respectivamente) (Fig. 1e). Para probar si los tiempos de incubación más cortos o más largos afectan la absorción de ADN, se determinó la eficiencia de transformación de alfa de 7 días después de una incubación de 6, 24 y 48 h con ADN (Fig. 1f). La transformación se detectó después de 6 h de incubación y aumentó después de 24 h (prueba de Kruskal-Wallis bilateral, H(2) = 8,769, P = 0,012 y la prueba de Dunn por pares con corrección de Bonferroni da P = 0,010 durante 6 y 24 h, P = 0,233 para 6 y 48 h, y P = 0,718 para 24 y 48 h). No es improbable que las diferencias en las propiedades de la membrana que ocurren durante el crecimiento celular puedan a su vez afectar la capacidad de absorción del ADN. La fluidez de la membrana es una medida de la viscosidad promedio de la bicapa lipídica, que puede afectar el posicionamiento y el movimiento de proteínas y lípidos dentro de la membrana20. Una mayor fluidez de la membrana se caracteriza por un mayor desorden de ácidos grasos, un menor empaquetamiento de lípidos y mayores tasas de difusión, lo que puede conducir a una mayor permeabilización de la membrana21,22. El análisis de la fluidez de la membrana de los cultivos de diferentes edades indicó que la mayor capacidad de absorción de ADN puede correlacionarse positivamente con la fluidez de la membrana, como se deduce de la polarización generalizada (GP, un GP más bajo indica una mayor fluidez)23 (Fig. 1g). aunque no se observaron diferencias estadísticamente significativas (ANOVA unidireccional de Welch, F(2, 2,798) = 13,226, P = 0,038, con prueba post hoc de Games-Howell: 1 a 3 días P = 0,068; 1 a 7 días P = 0,134 ; 3–7 días P = 0,711, n = 3). Una fluidez relativamente baja podría explicar por qué los protoplastos y las células S con deficiencia temporal de pared no pueden absorber el ADN de forma natural. Sin embargo, la fluidez de los protoplastos estuvo dentro del rango de cultivos de 1 a 7 días, medida mediante un ensayo en placa (Figura complementaria 2a). Un análisis posterior del GP mediante imágenes de microscopía de fluorescencia mostró que, aunque los protoplastos y las células S tienden a tener membranas menos fluidas, estos valores se mantienen dentro del rango de fluidez de la membrana de las formas L de 1 a 7 días de edad (Figura complementaria. 2b). Por lo tanto, aunque la fluidez de la membrana puede contribuir a la absorción eficiente del ADN, no es suficiente para explicar este proceso.

Para investigar más a fondo el mecanismo que facilita la absorción de ADN por las formas L, agregamos ADN plasmídico marcado con Cy5 a las formas L que expresan eGFP citoplasmática. Después de 3 días de incubación, se encontró ADN plasmídico marcado en el exterior de la membrana celular en forma de L o dentro de una vesícula interna aparente (Fig. 2a, Película complementaria 1 y Figura complementaria 3a de control). Como estas vesículas internas carecían de eGFP, razonamos que podrían haberse originado por un proceso de invaginación de la membrana, mediante el cual el material extracelular queda atrapado dentro de las vesículas. Para probar esto directamente, incubamos formas L que expresan eGFP con el tinte fluorescente SynapseRed C2M (SynapseRed). Dado que los tintes de estirilo, como SynapseRed (equivalente a FM5-95), no pueden difundirse a través de las membranas celulares24,25, cualquier señal fluorescente en las membranas que rodean las vesículas internas sería un fuerte argumento de que dichas vesículas derivan de la membrana celular. De hecho, se descubrió que SynapseRed no solo tiñe la membrana celular de las formas L sino también las membranas de las vesículas internas después de una incubación durante la noche (Fig. 2b). La tinción con SYTO 9 indicó además que el ADN cromosómico estaba presente en el citoplasma pero no dentro de las vesículas internas (Fig. 2c). La incubación de protoplastos que producen eGFP citoplasmática con SynapseRed mostró que las áreas con menos fluorescencia de eGFP citoplasmática fueron causadas por la presencia de estructuras de membrana interna en lugar de por la formación de vesículas internas (Fig. 2d). Una incubación similar de células S mostró la presencia de estructuras internas similares a vesículas desprovistas de eGFP citoplasmática. Sin embargo, a diferencia de las formas L, la tinción posterior de las células S que producen mCherry citoplasmática con SYTO 9 indicó que estas regiones oscuras estaban llenas de ADN cromosómico. Como SynapseRed es un tinte impermeable a la membrana, la tinción de las estructuras de la membrana en las células S puede reflejar una mayor permeabilidad de la membrana en lugar de una tinción debido a la invaginación de la membrana celular. Para probar la difusión del tinte a través de la membrana celular, se incubaron células L y S con SynapseRed a 30 °C y 4 °C para permitir y prevenir una posible invaginación de la membrana, respectivamente. Mientras que la membrana interna se tiñó en las células S tanto a 30 °C como a 4 °C, esto solo se observó a 30 °C para las formas L (Figura complementaria 3b). Esto sugiere que la tinción de una membrana en las células S con SynapseRed se debe a la permeabilidad de la membrana celular al tinte, a diferencia de las formas L, en las que la tinción es el resultado de la invaginación de la membrana celular.

Una micrografía de fluorescencia representativa de alfa pIJ82-GFP (eGFP citoplasmática; verde) incubada con ADN plasmídico marcado con Cy5 (pFL-ssgB; magenta) durante 3 días (n = 3 observaciones de un experimento). Campo claro BF. Véase también la película complementaria 1. b Incubación de alfa pIJ82-GFP después de una incubación durante la noche con el tinte impermeable a la membrana SynapseRed C2M (SynapseRed; magenta), que muestra dos cortes en z a diferentes alturas de una célula en forma de L. Se muestra una micrografía representativa de seis observaciones de un experimento. c Micrografía representativa de alfa (n = 7 observaciones de una incubación) y alfa pRed* (n = 9 observaciones de una incubación) teñidas con SYTO 9 (verde) para indicar ADN cromosómico. alfa se tiñe con SynapseRed C2M (SynapseRed; magenta) para visualizar las membranas celulares, mientras que (ausencia de) mCherry citoplasmático para alfa pRed* (magenta) indica la presencia de una vesícula interna. Se tomaron imágenes de las células directamente después de la adición de los tintes fluorescentes. d Imágenes representativas de protoplastos y células S de K. viridifaciens pIJ82-GFP que produce eGFP citoplásmica incubada con SynapseRed (SR) durante 72 h (filas superiores, al menos seis observaciones de dos experimentos independientes con células S y protoplastos), y S -células de K. viridifaciens pRed* que producen mCherry citoplásmico incubadas con SynapseRed y SYTO 9 durante 72 h (fila inferior, tres observaciones de un experimento). Tenga en cuenta que la presencia de estructuras de membrana interna y/o ADN puede provocar una reducción en la emisión de fluorescencia citoplasmática. e Imágenes fijas de un experimento de imágenes en lapso de tiempo de 950 minutos de DivIVA-eGFP (alfa pKR2) (verde) productor de alfa incubado con dextrano-Texas rojo de 3 kDa (D-TR; magenta) (n = 1). Las flechas indican la localización de DivIVA-eGFP. Véase también la película complementaria 2. f Micrografía representativa de la formación de focos y estructuras de anillos de DivIVA-eGFP en alfa pKR2 (verde) después de una incubación durante la noche con D-TR (magenta) (más de 50 observaciones de un experimento). Tenga en cuenta que las formas L pueden absorber ADN teñido con fluorescencia y dextrano mediante la formación de vesículas internas. g Eficiencia de transformación de alfa y alfaΔdivIVA de 7 días usando pFL-ssgB. ns no significativo (prueba t independiente bilateral, t(8) = 0,489, P = 0,638). Unidades formadoras de colonias UFC. Los datos se representaron como media ± DE con puntos de datos individuales, n = 5 réplicas biológicas. h Las formas L sin DivIVA pueden producir vesículas internas como se muestra para alfaΔdivIVA pIJ82-GFP de 5 días de edad que produce eGFP citoplasmática (n = 2 observaciones de un cultivo). Las barras de escala indican 2 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para comparar la presencia de supuestas estructuras de vesículas internas en los diferentes tipos de células, se cuantificó el porcentaje de formas L, protoplastos y células S con estas estructuras. Las células productoras de mCherry citoplasmático (alfa pRed* o células S y protoplastos derivados de K. viridifaciens pRed*) se incubaron con SynapseRed durante 0 y 3 días para teñir las membranas. El ADN se visualizó con SYTO 9 antes de obtener imágenes. Se cuantificó el número de células con regiones que carecen de emisión de fluorescencia desde el citoplasma, el ADN y la membrana, lo que podría indicar la presencia de vesículas internas (Tabla complementaria 2). Utilizando este método, las formas L tienen una incidencia entre 6 y 11 veces mayor de dichas regiones que las células S (formas L: 24,5 y 14,7 %; células S: 2,2 y 2,6 % después de 0 y 3 días de incubación, respectivamente), y rara vez se observaron supuestas vesículas en los protoplastos (<0,5%). Si estas regiones en las células S y los protoplastos fueran vesículas internas reales, su aparición probablemente no sea suficiente para detectar una transformación consistente con el ADN. En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que las vesículas observadas dentro de las formas L se originan a partir de la invaginación de la membrana celular, por lo que el ADN extracelular puede quedar atrapado dentro de dichas vesículas, mientras que esto no es evidente para las células S y los protoplastos.

En eucariotas, la endocitosis es un proceso que permite la absorción de carga externa mediante la formación de vesículas internas, que eventualmente se degrada o recicla26,27. Los dextranos marcados con fluorescencia se utilizan ampliamente como marcadores de endocitosis en eucariotas, ya que no pueden atravesar la membrana celular28,29. Para identificar si un proceso similar a la endocitosis podría estar presente en las formas L y visualizar la absorción de materiales externos, incubamos las células con Dextran-Texas Red (D-TR) y realizamos imágenes de lapso de tiempo. La cepa en forma L utilizada también expresa DivIVA-eGFP, que tiene una fuerte afinidad por las regiones de membrana curvadas negativamente (alfa pKR2)30. Se espera que estas regiones se formen tras la invaginación de la membrana. Después de 290 minutos de incubación, D-TR fue visible dentro de la forma L y comenzaron a aparecer puntos débiles de DivIVA-eGFP adyacentes a esta región (Fig. 2e y Película complementaria 2). Esto progresó a un claro abultamiento hacia adentro de la membrana celular con dos focos de DivIVA-eGFP a cada lado de la membrana invaginada y una entrada de D-TR (t = 560 min). Después de 640 min se formó una vesícula interna que contenía D-TR. En otras células, DivIVA-eGFP parecía formar una estructura similar a un anillo, que a veces envolvía la membrana invaginante (Fig. 2f, células 1 y 2). La presencia de DivIVA cerca del sitio de invaginación implica la presencia de regiones curvadas negativamente en la membrana. En particular, DivIVA no es necesario para la formación de vesículas o la absorción de ADN, ya que la eliminación de divIVA (alfaΔdivIVA) no tuvo efecto en la transformación (prueba t independiente bilateral, t(8) = 0,489, P = 0,638) (Fig. 2g ), y esta cepa todavía formaba vesículas internas (Fig. 2h). Además, también se observó la internalización de D-TR en formas L que no expresaban DivIVA-eGFP, lo que indica que la captación no es consecuencia de la presencia de la proteína de fusión (Figura complementaria 3c). La incubación de protoplastos y células S con D-TR hasta 72 h no dio como resultado una encapsulación clara de D-TR en vesículas internas (Figura complementaria 3d). Para cuantificar esto, las células que producen eGFP citoplasmática se incubaron con D-TR o PBS durante 72 h. Se contó el porcentaje de células con regiones que carecían de eGFP pero que contenían D-TR en esta región. La incubación repetida (por duplicado) dio como resultado la absorción de D-TR en alrededor del 6% de las células en forma L y ninguna absorción para el control con PBS (Tabla complementaria 3). No se observó una absorción clara para las células S y los protoplastos incubados con D-TR en comparación con las células de control incubadas con PBS (células S: 0,9 y 1,7 % con D-TR versus 0 y 2,1 % con PBS; protoplastos: 0 y 1,1 % con D-TR versus 0 y 0,8% con PBS). En conjunto, estos resultados muestran que la invaginación de la membrana celular de las formas L puede conducir a la formación de vesículas internas y puede representar un mecanismo similar a la endocitosis que permite la absorción de moléculas, incluido el ADN, del medio ambiente.

Las nanopartículas lipídicas (LNP) son partículas no virales que se utilizan para administrar ácidos nucleicos y fármacos a las células humanas mediante endocitosis31. Los LNP no tienen una estructura de bicapa lipídica, sino que consisten en un núcleo hidrofóbico de lípidos densos en electrones que encapsulan ácidos nucleicos mediante interacciones electrostáticas y están rodeados por una capa de lípidos PEG31. Los LNP internalizados se encuentran en endosomas que son orgánulos unidos a membranas de la vía endocítica. La acidificación posterior hace que los lípidos ionizables de las LNP se carguen positivamente, lo que permite que las LNP desestabilicen la membrana endosómica y entreguen su carga al interior de la célula. Los LNP también pueden marcarse con fluorescencia mediante la incorporación de fosfolípidos conjugados con fluoróforos. Para explorar más a fondo la capacidad de las formas L para absorber partículas externas grandes, las células se incubaron con LNP marcados con rodamina (LNP-LR, que contiene 18:1 Liss Rhod PE) con un tamaño promedio de 150 nm, para permitir su detección. dentro de formas L. Después de agregar LNP-LR a formas L de 7 días, se pudo detectar una señal fluorescente clara, probablemente generada por múltiples partículas de LNP, dentro de las células después de una incubación durante la noche, así como la localización de LNP en la membrana celular (Fig. 3a y Fig. complementaria 4a, b). Cuando se utilizaron formas L que produjeron eGFP en el citoplasma, las vesículas solo contenían LNP y no eGFP, lo que sugiere fuertemente que las LNP se habían internalizado en vesículas desprovistas de citoplasma (Fig. 3b, cy control de imágenes, Fig. complementaria 4c). Es importante destacar que la adición del inhibidor metabólico azida sódica (1, 2,5 o 10 mM), que se dirige a la cadena respiratoria32, o la incubación de células a 4 °C afectó la localización de LNP-LR (Fig. 3d, e y Fig. complementaria .4d-i). Estas condiciones se utilizan comúnmente para inhibir la endocitosis al reprimir la producción de energía33,34. En tales condiciones, las LNP parecían localizarse en la membrana celular en lugar de dentro de la célula. El efecto inhibidor de la azida sódica y la incubación a 4 °C sobre la absorción de material extracelular por las formas L se cuantificó utilizando D-TR, ya que capturar la absorción de LNP-LR era demasiado poco frecuente para cuantificarlo con precisión. Sorprendentemente, se observó una reducción significativa de la captación de D-TR por las formas L en presencia de azida sódica 2,5 mM (5,9% versus 1,9% de las células que mostraron captación de D-TR para el control y azida sódica, respectivamente (dos proporciones z- prueba, z = 3.111, P unilateral <0.001), y la incubación de formas L a 4 ° C inhibió completamente la absorción de D-TR (Fig. 3f). Estos resultados son consistentes con un proceso de absorción en formas L que es dependiente de energía, por lo que el material externo se internaliza mediante un proceso de invaginación de la membrana.

a, b Micrografías representativas de la localización de LNP-LR (nanopartículas lipídicas que contienen 18:1 Liss Rhod PE; magenta) en vesículas internas de alfa (a; n = 5 observaciones) y alfa pIJ82-GFP (b; n = 2 observaciones) después de un experimento de incubación durante la noche y 3 días a 30 °C, respectivamente. c Gráfico del perfil de densidad de los valores de gris (intensidad de píxeles) de la selección de línea correspondiente de alfa pIJ82-GFP (b) incubada con LNP-LR que muestra que una disminución en la emisión citoplasmática de eGFP se correlaciona con un aumento en la emisión de LNP-LR. d, e Localización de LNP-LR durante la incubación con alfa a 4 °C (d) o en presencia de azida sódica (NaN3) 2,5 mM a 30 °C (e) después de 0, 24 y 48 h de incubación . Se obtuvieron resultados similares con azida sódica 1 y 10 mM (consulte la figura complementaria 4). Se obtuvieron imágenes de un experimento. f Porcentaje de células alfa pIJ82-GFP que muestran captación de rojo de dextrano-Texas (D-TR) después de una incubación de 3 días a 30 °C (control), en presencia de azida sódica (NaN3) 2,5 mM o incubadas a 4 °C. Se observó una reducción significativa en la absorción de D-TR para la azida sódica (prueba z de dos proporciones, z = 3,111, unilateral, P = 0,00093) y después de la incubación a 4 °C no se detectó absorción (ND). Los asteriscos (***) indican P ≤ 0,001. El porcentaje de células con captación de D-TR y el número total de células analizadas se proporcionan para cada condición y se basan en recuentos celulares combinados de dos incubaciones replicadas. Tenga en cuenta que la incubación de formas L con nanopartículas lipídicas (tamaño promedio de 150 nm) da como resultado su localización dentro de vesículas internas, y que la absorción de partículas externas se inhibe mediante la incubación a 4 ° C o con azida de sodio. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para comprender mejor la ultraestructura y composición de las vesículas intracelulares, se tomaron imágenes de las formas L utilizando microscopía electrónica y de luz criocorrelativa 3D (crio-CLEM) (Fig. 4a). Cryo-FIB-SEM (microscopía electrónica de barrido con haz de iones enfocado) permite obtener imágenes en 3D de alta resolución de formas L y vesículas internas. La preparación de muestras criogénicas y las imágenes garantizan que las formas L se visualicen en un estado casi nativo mediante una congelación rápida en condiciones de alta presión que permiten la transformación del líquido en hielo amorfo35,36,37.

a Ejemplo de micrografías electrónicas y de fluorescencia correlacionadas de alfa pIJ82-GFP (imagen de Zen Connect) realizadas con todas las células fotografiadas. Una trama finderTOP visible tanto en fluorescencia como en microscopía electrónica facilita la alineación entre los dos módulos de imágenes. Los cuadrados indican diferentes regiones de interés, fotografiadas con mayor resolución. Haz de iones enfocado FIB-SEM: microscopía electrónica de barrido, luz de fluorescencia FL. b Ejemplo de una imagen de mayor resolución de una región de interés (ROI) seleccionada, que muestra muchas células fluorescentes. c Micrografía de fluorescencia de la forma L representada por el cuadro blanco en (b), que muestra una esfera oscura intracelular (~ 1 μm, flecha blanca), como se realizó para seleccionar todas las células de interés. Las flechas X, Y y Z en (b – d) indican la orientación 3D de la celda fotografiada como se observa en 3D FIB-SEM. d Imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM) (SE, Inlens) de la célula en (c) (tamaño ~6 μm) con una flecha que indica la vesícula interna (n = 1 célula). e Superposición de cinco cortes consecutivos (imágenes retrodispersadas) de celda en (d). Recuadro: gráfico del perfil de densidad (blanco) de los valores de gris promedio (intensidad de píxeles) para la región en el cuadro blanco (n = 1 celda). f – i Cortes FIB-SEM que muestran diferentes tipos de vesículas internas de tres células fotografiadas. Vesículas que recubren la membrana celular de las células de aproximadamente 3,5 μm de tamaño (f, g). Los asteriscos indican vesículas en (f, g). Complejo vesicular (h) con diferente espesor de membrana de vesículas indicado con flechas blancas. Consulte también la figura complementaria 7a y la película complementaria 3. (i) Protuberancias de la membrana como se indica con una flecha blanca. j – q Análisis de las vesículas interconectadas de la célula en (i) (n = 1). j–l Tres cortes consecutivos que muestran la interacción de diferentes vesículas. n – p muestran una mayor ampliación de las regiones en cuadros blancos en j – l, respectivamente. m, q Segmentación 3D de n – p. Si bien algunas de las vesículas son intracelulares, otras sobresalen de la célula. Una estructura de vesícula conectada completa se muestra en verde (m, q) y se indica con flechas blancas (i, j, l, m). Consulte la figura complementaria 7b – d y la película complementaria 4. La celda en los paneles h – q tiene un tamaño de alrededor de 4 μm. r – u Las regiones con diferente contraste (indicadas por regiones coloreadas) están revestidas con partículas negras que representan cuerpos lipídicos putativos como se muestra para una célula (regiones similares observadas en tres células). Esta celda tiene un tamaño de ~3,6 μm y se relaciona con el panel (g). La distribución de tamaño de las partículas negras es de 25 a 60 nm. Las barras de escala representan 500 nm a menos que se especifique lo contrario. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Después de la congelación a alta presión, se detectaron células con supuestas vesículas intracelulares en función de regiones internas más oscuras que carecían de eGFP citoplasmática utilizando alfa pIJ82-GFP (Figura complementaria 5). Se obtuvieron imágenes en detalle de formas L específicas (ejemplo de selección en la Fig. 4b, c) utilizando crio-FIB-SEM. De hecho, la reducción de eGFP citoplasmática coincidió con la presencia de vesículas internas detectadas por FIB-SEM (Fig. 4c, d, flecha blanca), de acuerdo con resultados anteriores (Fig. 2b). Además, la composición del citoplasma y el contenido de las vesículas internas fue diferente, según se midió utilizando el detector retrodispersado selectivo de energía (EsB) InLens que proporciona contraste basado en la distribución de elementos más pesados (Fig. 4e). El análisis de la intensidad de los píxeles indicó que el nivel de contraste dentro de la vesícula interna era similar al entorno extracelular, mientras que el citoplasma tenía un contraste mayor. Además, un experimento de sobreexposición demostró que la vesícula tiene la misma capacidad para absorber la dosis de electrones que el medio exterior, a diferencia del resto de la célula (Figuras complementarias 6a, b). Estos resultados respaldan el hallazgo de que las vesículas internas contienen medio extracelular y se forman mediante invaginación de la membrana (Fig. 2).

Otras imágenes de alta resolución indicaron la presencia de múltiples vesículas internas dentro de células individuales (Fig. 4f – i, Fig. complementaria 6c – e). La mayoría de las vesículas detectadas recubrían la membrana celular (Fig. 4g y Fig. Suplementaria 6c-e), variaban en tamaño y grosor de la membrana (Fig. 4h) e incluso podían estar presentes dentro de vesículas más grandes (Fig. 4h y Fig. Suplementaria 7a). . La presencia de vesículas dentro de otras vesículas también se ha observado mediante microscopía de fluorescencia (Figura complementaria 3c, flecha blanca), que muestra una vesícula no fluorescente dentro de una vesícula más grande que encapsula D-TR. Además, se pudieron observar vesículas brotando de la membrana celular (Fig. 4i). La reconstrucción 3D de las vesículas en ciernes basada en el trazado del contorno reveló que eran una extensión de una vesícula interna o permanecían conectadas a las vesículas internas, formando un complejo (Fig. 4j-q, Fig. Suplementaria 7a-d y Películas complementarias 3). , 4).

En algunos casos, las células contenían regiones intracelulares con valores de gris diferentes a los del resto de la célula (Fig. 4r-u). Estas regiones tenían una distribución de tamaño de 300 a 800 nm, no recubrían la membrana celular y estaban rodeadas por partículas oscuras de alrededor de 25 a 60 nm de diámetro. Podría ser posible que estas partículas oscuras sean cuerpos lipídicos, en comparación con observaciones crio-FIB-SEM anteriores38,39. Una posible interpretación es que las regiones internas son vesículas cuya membrana lipídica circundante se ha degradado parcialmente. Los lípidos y los productos de degradación lipídica pueden haberse acumulado en gotitas de lípidos que dan como resultado las partículas negras observadas. Para capturar la degradación de las vesículas internas, se realizaron imágenes de lapso de tiempo durante la noche en formas L que expresan mCherry citoplasmático (alfa pRed*). Las vesículas se identificaron por la falta de mCherry citoplásmico y se tomaron imágenes de las células en diferentes alturas Z para confirmar que la vesícula no se había simplemente movido de ubicación. Se observó rotura de vesículas utilizando formas L de 2 días resuspendidas en medio LPB nuevo (Película complementaria 5). Se capturaron dos eventos más de ruptura de vesículas después de realizar un lapso de tiempo sucesivo en la misma muestra, pero con células diferentes (Películas complementarias 6, 7). Todas las vesículas fotografiadas ya estaban presentes en las células al comienzo del lapso de tiempo. Mientras que el tiempo transcurrido hasta la ruptura de las vesículas varió mucho (después de 1 hora o después de 13 y 17 h para el segundo experimento), el proceso de ruptura en sí ocurrió dentro de los 15 minutos, que fue el intervalo de tiempo entre imágenes consecutivas. Estos hallazgos refuerzan el modelo de que las vesículas internas de las formas L pueden alterarse y, de esta manera, liberar su contenido en el citoplasma.

Estos resultados confirman además que las vesículas internas observadas en las formas L de K. viridifaciens contienen medio externo y pueden formarse mediante la invaginación de la membrana celular. Las formas L pueden contener múltiples vesículas de diferentes tamaños, formando en algunos casos grupos o complejos de vesículas que pueden sobresalir de la membrana celular. Las vesículas internas pueden liberar su contenido al interior de la célula después de la degradación de las vesículas. Estos hallazgos respaldan un modelo para la absorción de macromoléculas como el ADN por absorción, seguida de la liberación de la carga después de la rotura de la vesícula (Fig. 5).

La invaginación de la membrana celular conduce a la formación de vesículas internas en forma de L. A medida que la membrana celular se hincha hacia adentro, el líquido extracelular que contiene ADN u otras macromoléculas es absorbido. El mecanismo subyacente al proceso de invaginación depende de la energía y podría basarse en una mayor síntesis de membrana y una alta fluidez de la membrana o estar mediado por proteínas similares a las involucradas en la endocitosis eucariota, como las proteínas citoesqueléticas. El ADN se libera de las vesículas internas mediante un proceso desconocido (indicado por una flecha discontinua), que puede implicar la rotura de las vesículas. Imagen creada con BioRender.com.

La pared celular bacteriana es una importante barrera protectora del medio ambiente, que proporciona resistencia al estrés y permite el paso selectivo de moléculas. Sin embargo, en los últimos años ha quedado claro que, en determinadas condiciones, las bacterias también pueden prosperar sin esta capa. La exposición prolongada a tensiones ambientales, como agentes dirigidos a la pared celular o una presión osmótica alta, puede inducir la formación de formas L que proliferan eficientemente sin su pared celular7. Se desconocen en gran medida las consecuencias de un estilo de vida bacteriano tan deficiente en la pared sobre su capacidad para absorber ADN. Aquí proporcionamos evidencia de que las formas L pueden absorber ADN y otras macromoléculas mediante la absorción y la posterior formación de vesículas internas (Fig. 5).

Los mecanismos bien conocidos para la TGH son la transformación natural, la transducción y la conjugación40. Estos mecanismos requieren maquinaria sofisticada para permitir el transporte de ADN a través de la envoltura celular. Aquí mostramos que las células con deficiencia de pared, como los protoplastos, las células S y las formas L de K. viridifaciens, captan ADN utilizando PEG. Es importante destacar que las formas L son las únicas células con deficiencia de pared que logran una transformación espontánea consistente utilizando ADN plasmídico sin PEG. No se observó ninguna transformación cuando se utilizó ADN genómico sin utilizar PEG. Esto probablemente se deba al número ~200 veces menor de moléculas de ADNg utilizadas en comparación con el ADN plasmídico, así como al requisito de una doble recombinación del ADN genómico con el cromosoma para la integración estable del casete de resistencia a los antibióticos, lo que probablemente conduce a una menor eficiencia de transformación.

Las bacterias naturalmente transformables utilizan un sistema canónico y complejo para la captación de ADN a través de la pared celular y la membrana celular. El último paso requiere la proteína de unión al ADN ComEA y la proteína del canal formador de poros ComEC, con homólogos encontrados en especies Gram positivas y Gram negativas naturalmente transformables (p. ej., ComE y ComA en N. gonorrhoeae). La alteración de cualquiera de estas proteínas normalmente da como resultado una reducción drástica o incluso la ausencia de transformación15,16,41,42. Sin embargo, la alteración de genes con homología con comEA y comEC en las formas L de K. viridifaciens no tuvo ningún efecto sobre su capacidad para captar ADN, lo que sugiere un mecanismo independiente de la maquinaria de transformación genética natural canónica.

La endocitosis es un proceso fundamental y altamente regulado en eucariotas que participa en la absorción de nutrientes, la regulación de la composición de la membrana plasmática, la detección del entorno extracelular y la señalización43. La invaginación de la membrana y la posterior escisión de la membrana y formación de vesículas permiten a las células internalizar una amplia gama de cargas, como líquidos, ligandos, proteínas de la membrana plasmática y, a veces, incluso bacterias enteras. La invaginación suele ir seguida del paso de la carga a través de la vía endosómica y la degradación lisosomal26. Células específicas de mamíferos pueden captar ADN, seguido de una expresión genética activa44, que potencialmente ocurre mediante endocitosis, aunque el mecanismo exacto no está claro45. Este trabajo muestra que las formas L utilizan un mecanismo similar a la endocitosis para la captación de ADN, mediante el cual la invaginación de la membrana conduce a la formación de vesículas intracelulares que, durante su formación, encapsulan material extracelular (Fig. 5). A través de este proceso, no solo se encapsuló ADN sino también otras macromoléculas como el dextrano de 3 kDa e incluso nanopartículas lipídicas de 150 nm, lo que sugiere fuertemente que el proceso de absorción no es específico. El proceso de absorción se ve inhibido por condiciones que reducen la actividad metabólica y la producción de energía. Curiosamente, un estudio anterior también informa la absorción de dextranos fluorescentes en vesículas internas de formas L de Bacillus subtilis, que se propuso que ocurriera mediante endocitosis en fase fluida46.

Se desconoce el mecanismo exacto que subyace a la formación de vesículas intracelulares en formas L, pero puede depender del aumento de la dinámica de la membrana debido al exceso de síntesis de membrana6,47. Un desequilibrio en la relación superficie-volumen celular debido al exceso de síntesis de membrana puede conducir a la formación de vesículas internas en mutantes de forma esférica de E. coli y B. subtilis6,48. También se pueden formar vesículas o vacuolas internas en protoplastos y esferoplastos agrandados (estos últimos contienen una membrana externa) que se mantienen en condiciones que permiten la expansión de la membrana celular49,50. De hecho, la falta de producción excesiva de membrana también puede explicar por qué no observamos una absorción constante de ADN en los protoplastos y las células S, los cuales son incapaces de proliferar sin su pared. Sin embargo, no podemos excluir si proteínas similares a las involucradas en la endocitosis eucariota, como proteínas de cubierta, maquinaria de escisión o proteínas citoesqueléticas43, están involucradas en la formación de vesículas internas en formas L. Sin embargo, cabe señalar que las formas L de B. subtilis no dependen de proteínas citoesqueléticas conocidas para la deformación y proliferación de la membrana51.

Las imágenes de microscopía electrónica de alta resolución revelaron múltiples vesículas internas dentro de las células en forma de L. Curiosamente, las formas L también contenían regiones que no estaban rodeadas por una membrana, sino que estaban revestidas con manchas más oscuras. Estas manchas oscuras, que se generan por la carga local de los electrones con el material, fueron descritas previamente como cuerpos proteicos o lipídicos38,39, y posiblemente se originen a partir de los productos de degradación de la membrana de las vesículas internas. La probable desintegración de las vesículas internas también se capturó mediante imágenes de lapso de tiempo. Esta desintegración conduciría a la liberación de la carga de la vesícula hacia el citoplasma. En eucariotas, el escape de la terapéutica de las vesículas endosómicas puede estar mediado por agentes bacterianos, virales y químicos o por nanopartículas52,53. Los mecanismos de escape incluyen la formación de poros, la desestabilización de la membrana, la hinchazón de las nanopartículas o la ruptura osmótica. Los niveles elevados de sacarosa o el efecto esponja de protones facilitan la entrada de protones seguida de la acumulación de iones cloruro y la entrada de agua, lo que lleva a la rotura de la vesícula54,55. La acidificación de los endosomas se produce a través de ATPasas vacuolares localizadas en la membrana (V-ATPasas) que bombean protones hacia las vesículas56. Las bacterias tienen bombas de protones similares llamadas F-ATPasas en su membrana plasmática y se han encontrado en la membrana de vesículas intracelulares de protoplastos agrandados57. Teniendo en cuenta la complejidad de los mecanismos de escape conocidos, se requiere más investigación para comprender cómo las vesículas internas en forma de L pueden desintegrarse para liberar su contenido en el citoplasma.

Las formas de vida modernas son sistemas biológicos complejos, que probablemente evolucionaron a partir de células mucho más simples. Dos sistemas modelo para estudiar supuestas formas de vida tempranas son las vesículas lipídicas gigantes y las formas L debido a su falta de pared celular y forma biofísica de proliferación8,9. Se cree que la transferencia horizontal de genes ha desempeñado un papel fundamental en la evolución de los primeros años de vida58. Esto puede haber ocurrido en células que aún no desarrollaron una pared celular, lo que permitió la recombinación genética después de la fusión celular o la electroporación provocada por un rayo59,60; sin embargo, se desconocían otros mecanismos de la TGH. Se han observado vesículas internas en formas L de otras especies bacterianas, describiéndose diversas funciones y mecanismos de formación de vesículas61,62. Las formas L de Listeria monocytogenes son capaces de formar vesículas internas que contienen ADN a lo largo del interior de la membrana celular, que al liberarse se vuelven metabólicamente activas63,64, así como también forman vesículas internas mediante invaginación de la membrana, que probablemente contienen medio extracelular47. Además, la invaginación secundaria de la propia membrana de la vesícula puede dar lugar a vesículas que contienen citoplasma y representan una descendencia viable.

Curiosamente, el trabajo preliminar muestra que las formas L de L. monocytogenes también tienen la capacidad de absorber ADN plasmídico extracelular y transformarse sin el uso de PEG65. No se sabe que esta especie bacteriana sea naturalmente transformable y no contiene un sistema de competencia funcional. Esto sugiere que un mecanismo similar a la endocitosis similar al observado en las formas L de K. viridifaciens podría ser responsable de la captación de ADN. Estos ejemplos proporcionan apoyo adicional a la existencia de endocitosis bacteriana.

Un estudio reciente informa similitudes entre los microfósiles esféricos y los protoplastos sin paredes66. Cuando los protoplastos se cultivaron en condiciones que imitan las supuestas condiciones del Eón Arcaico, el período en el que se formó la vida en la Tierra, se formaron vesículas intracelulares. Estas vesículas también se observaron en microfósiles de entre 3.500 y 2.400 millones de años de antigüedad, lo que sugiere que las células sin paredes pueden haber estado presentes en la antigüedad. Sin embargo, cabe señalar que también se pueden formar células sin pared a partir de bacterias con pared. Por ejemplo, se ha demostrado que los micoplasmas sin pared se derivan de bacterias con pared a través de evolución degenerativa67, y las formas L generadas en el laboratorio también se originan a partir de células con pared. Es posible que las formas L no hayan sido las células primordiales en sí mismas, sino que funcionen como un modelo para estudiar supuestas formas de vida temprana. Por lo tanto, proponemos que el proceso similar a la endocitosis observado en las formas L refleja un mecanismo antiguo de cómo las células primordiales pueden haber adquirido nuevo material genético y nutrientes a través de la absorción antes de la invención de la pared celular.

En conclusión, nuestro trabajo muestra que la pérdida permanente de la pared celular bacteriana permite la absorción de ADN, dextrano y nanopartículas lipídicas de 150 nm de tamaño mediante la formación de vesículas internas. La invaginación de la membrana celular conduce a la absorción de fluidos externos y la posterior formación de vesículas. Con el tiempo, la vesícula puede romperse, lo que resulta en la liberación de la carga hacia el citoplasma. Se trata de un proceso dependiente de energía que tiene similitudes con una forma simple de endocitosis como la que se observa en los eucariotas. Se requieren estudios futuros para comprender mejor los mecanismos moleculares detrás de este proceso.

Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en las tablas complementarias 4 y 5, respectivamente. Las líneas celulares bacterianas están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Kitasatospora viridifaciens DSM4023968 se cultivó de forma confluente en medio de extracto de levadura y maltosa (MYM) para obtener esporas, que se recolectaron después de 3 a 4 días de crecimiento69. En resumen, las esporas se resuspendieron en MilliQ usando un hisopo de algodón y se filtraron a través de una jeringa llena de algodón. Las esporas se resuspendieron en glicerol al 20% (v/v) (G1345, Duchefa Biochemie) y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Para el crecimiento micelial en líquido, K. viridifaciens se cultivó durante la noche a una densidad de 1 × 106 esporas ml-1 en caldo de fase L (LPB) sin sacarosa a 200 rpm. Las cepas se cultivaron durante 2 días en LPB con sacarosa (S0809, Duchefa Biochemie) a 100 rpm para inducir la formación de células S7. Las formas L se cultivaron en medio agar sólido de fase L (LPMA) o LPB7 líquido. Los cultivos líquidos se inocularon con esporas para las cepas de K. viridifaciens o con una alícuota congelada de un cultivo en forma L de 1 a 2 días de edad en el caso de las cepas en forma L. Las formas L se cultivaron en cultivo líquido durante 3 a 4 días para la transformación química y 7 días para todos los demás experimentos, a menos que se indique específicamente. Las formas L se ajustaron a 5–7,5 × 107 UFC ml-1 para los ensayos de transformación (basado en la DO600 de 3 para células de 3 y 7 días y 0,2 para células de 1 día), y 2,5–5 × 107 UFC ml-1 (OD600 de 2) para todos los demás experimentos con células de 7 días. Todos los cultivos de Kitasatospora se cultivaron a 30 °C.

Cuando sea necesario, antibióticos (100 µg ml-1 ampicilina, K029, Roth; 25 µg ml-1 cloranfenicol, C0113; Duchefa Biochemie; 5 µg ml-1 tiostreptón, 598226, Calbiochem; 50 µg ml-1 apramicina, A0164, Duchefa Biochemie ; se añadieron al medio de cultivo 100 µg ml-1 de higromicina B, K547, Amresco, con la excepción de 200 µg ml-1 de higromicina B para el medio LB). Las cepas de Escherichia coli se cultivaron en medio LB sólido o líquido (mientras se agitaba a 250 rpm) a 37 °C. Se usó coli JM10970 para fines de clonación y para obtener ADN plasmídico metilado, mientras que se usó E. coli ET12567/pUZ800271 para obtener ADN deficiente en metilación. ADN.

Todas las PCR se realizaron utilizando PFU o ADN polimerasa de alta fidelidad (NEB) Q5®. Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 6. Se utilizó GeneRuler DNA Ladder Mix (SM0334, Thermo Scientific) para confirmar el tamaño de las moléculas de ADN mediante electroforesis en gel. Para crear pFL-ssgB (Tabla complementaria 5), se amplificó un casete de resistencia a higromicina utilizando el par de cebadores Hyg_F-231_EEV y Hyg_R + 1237_HEV con pMS8272 como plantilla. Los productos de la PCR se digirieron con EcoRV y se clonaron en pWHM3-oriT73 para generar pWHM3-oriT-hyg (Tabla complementaria 5). El flanco 3' de ssgB se digirió a partir de pKR17 y se clonó en pWHM3-oriT-hyg usando XbaI y HindIII para generar el plásmido final. Todas las enzimas de restricción se encargaron a New England Biolabs.

pRK1 (Tabla complementaria 5) se creó amplificando la región flanqueante aguas arriba de comEA mediante PCR con los cebadores FL1-comEA/comEC-FW y FL1-comEA/comEC-REV, introduciendo así sitios de restricción únicos EcoRI y XbaI, mientras que la región flanqueante aguas abajo de comEC, elaborado mediante síntesis de genes (Baseclear, Leiden, Países Bajos) estaba flanqueado por los sitios XbaI y HindIII. Las regiones flanqueantes y el casete de apramicina se clonaron en pWHM3-oriT usando los sitios de restricción EcoRI, HindIII intercalados con un casete de resistencia a apramicina que contenía sitios XbaI flanqueantes, creando así el plásmido final. El mutante de deleción comEA/comEC se creó en la cepa alfa7 en forma L usando pRK1, que reemplazó los nucleótidos +58 con respecto al codón de inicio de comEA (BOQ63_029625) hasta + 2489 con respecto al codón de inicio de comEC (BOQ63_029630) con una resistencia a apramicina. casete. Tenga en cuenta que la anotación genética de Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (acceso CP023698) se utilizó para determinar los codones de inicio y parada supuestamente correctos para comEC, lo que dio como resultado la ubicación del genoma 5.041.836 a 5.044.433 en CP090841.

Para crear pIJ82-GFP, la región que contiene el gen eGFP con un promotor gap1 se amplificó a partir de pGreen74 utilizando el par de cebadores gap1_FW_BglII y egfp_RV_EcoRI. El producto de la PCR resultante se clonó en pIJ82 usando BglII y EcoRI para generar el plásmido final.

Para crear nuevas cepas en forma L, se logró la transformación de alfa con ADN plasmídico mediante transformación química basada en polietilenglicol (PEG)10 como se describe a continuación. Se aisló ADN plasmídico de Escherichia coli ET12567/pUZ8002 para obtener ADN deficiente en metilación. Las cepas en forma L alfa pIJ82-GFP y alfaΔdivIVA pIJ82-GFP se crearon mediante transformación química de alfa y alfaΔdivIVA con pIJ82-GFP, respectivamente, seguida de selección con higromicina B (Tabla complementaria 4). Las cepas se verificaron mediante la detección de la producción de eGFP fluorescente mediante microscopía de fluorescencia. La cepa alfaΔcomEA/EC se obtuvo mediante transformación química de alfa con pRK1 seguida de selección de apramicina (Tabla complementaria 4). El crecimiento posterior en un medio no selectivo permitió una doble recombinación homóloga que condujo a la sustitución de la región comEA/EC por un casete de resistencia a apramicina, lo que dio lugar a células sensibles a tiostreptón y resistentes a apramicina. La cepa se verificó mediante PCR utilizando el par de cebadores ComEA_Apra_check_FW y ComEC_Apra_check_RV para confirmar la sustitución de la región por el casete de apramicina. Para confirmar aún más la eliminación de esta región, se realizó una PCR utilizando los pares de cebadores ComEC_Presence_Check_1_FW/RV y ComEC_Presence_Check_2_FW/RV, que amplifican partes de comEC solo si esta región genómica todavía está presente.

Se aisló ADN genómico de un cultivo de alfaΔssgB7 de 5 días mediante extracción con fenol:cloroformo10. Brevemente, el sedimento celular se resuspendió en sacarosa al 10,3% (p/v) que contenía ácido etilendiaminotetraacético 0,01 M (EDTA, 20296.291, VWR Chemicals BDH) pH = 8, después de la lisis con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% (p/v). , 20765.02, Servá). Se realizó una extracción con fenol:cloroformo (mezcla 1:1 de fenol, 10001173, Fisher BioReagentstm y cloroformo, 32211, Honeywell) y los ácidos nucleicos se precipitaron usando isopropanol (33539, Honeywell). El sedimento se disolvió en tampón Tris-EDTA (base Trizma®, RDD008, Sigma-Aldrich), seguido de tratamiento con RNasa A (EN0531, Thermo Fisher) y Proteinasa K (19131, Qiagen). El ADNg se aisló mediante extracción con fenol:cloroformo y se precipitó con etanol absoluto (5250501, Biosolve) antes de la resuspensión en agua libre de nucleasas. El ADNg fragmentado se obtuvo batiendo el ADNg intacto durante 12 minutos utilizando perlas de vidrio de 2 mm de diámetro en un Mikro-Dismembrator U (Sartorius) a 2000 rpm. Las concentraciones de ADN cromosómico se verificaron utilizando el kit de ensayo de ADNds de amplio rango Quant-IT™ (Q33130, Invitrogen).

La cepa DSM40239 de K. viridifaciens se inoculó a una densidad de 5 × 106 esporas ml-1 en medio líquido TSBS:YEME (1:1) con 0,5% (p/v) de glicina (G0709, Duchefa Biochemie) y MgCl2 5 mM (M0533). , Duchefa Biochemie). El cultivo se hizo crecer durante 48 h mientras se agitaba a 200 rpm, después de lo cual se prepararon los protoplastos10. Se utilizaron cultivos de 72 h para K. viridifaciens pIJ82-GFP y K. viridifaciens pRed*. Las células se lavaron con sacarosa al 10,3% (p/v) antes de realizar el tratamiento con lisozima mediante la adición de 10 mg ml-1 de lisozima de clara de huevo de gallina (~ 70.000 U mg-1, 62971, Sigma-Aldrich). Las células se incubaron durante 2 a 3 h a 100 rpm y 30 °C, después de lo cual los fragmentos de micelio se separaron de los protoplastos mediante filtración a través de un filtro de algodón. Las células se concentraron mediante centrifugación a 1000 xg si era necesario.

Las células S se aislaron de cultivos de LPB mediante filtración7. En resumen, el cultivo se filtró a través de un filtro EcoCloth™ estéril (AMEC0003, Contec) y posteriormente se pasó a través de un filtro de membrana Isopore™ de 5 µm (TMTP01300, Merck). Las células se concentraron mediante centrifugación suave a 1000 xg durante 20 minutos, después de lo cual se eliminó el 90% del sobrenadante. El sedimento celular se resuspendió cuidadosamente en el líquido restante. Para probar una alta concentración de células S para detectar la captación espontánea de ADN, se inoculó K. viridifaciens a 1 x 107 esporas ml-1 y la filtración solo se realizó a través del filtro EcoCloth™.

Los protoplastos, células S, formas L o células miceliares recién preparados se mantuvieron en hielo antes de la transformación. Para la transformación química, se mezclaron 50 µl de células con 1 µg de pRed*75, 150 ng de ADNg de la cepa alfaΔssgB, células lisadas con sal esterilizadas por filtración (35 ng de ADN de alfaΔssgB) o MilliQ. Luego, se agregaron a las células 200 µl de PEG 1000 al 25% (p/v) (14805-B, NBS Biologicals) en tampón P10, seguido de mezclar y diluir suavemente la suspensión en tampón P. Se sembraron diluciones en serie en medio LPMA y después de una incubación de 16 a 18 h, se realizó una superposición con 1 ml de tampón P que contenía antibióticos. Las unidades formadoras de colonias (UFC) se contaron después de 7 días para las formas L y micelio o después de 14 días para las células S y protoplastos. Los transformantes se verificaron mediante rayado en un medio selectivo y microscopía.

Las células recién preparadas se incubaron con 30 ng µl-1 de ADN no metilado (pRed* o pFL-ssgB como se indica) o MilliQ durante 18 a 24 h a 100 rpm, a menos que se indique lo contrario. Se usó una concentración final de 100 o 10 ng µl-1 de ADNg intacto y 10 ng ul-1 para ADNg fragmentado aislado de alfaΔssgB en combinación con alfa de 1 y 7 días. Las diluciones se sembraron en LPMA selectiva y no selectiva después de una cuidadosa resuspensión. Las células miceliares se diluyeron de manera similar en medio MYM. Las unidades formadoras de colonias se determinaron después de una incubación de 7 días a 30 °C para las formas L y micelio y hasta 14 días para los protoplastos y las células S. Los transformantes se verificaron mediante crecimiento en un medio selectivo y mediante PCR (usando los cebadores Tsr_Hyg_FW1 y Tsr_Hyg_RV1) o microscopía. Las células se prepararon a partir de al menos cinco cultivos réplica para comparar las eficiencias de transformación entre cepas. La absorción de ADN de las células S se probó utilizando un filtrado obtenido mediante el procedimiento estándar, así como un filtrado más concentrado que se obtuvo mediante la inoculación de 1 × 107 esporas ml-1 y la filtración del cultivo bacteriano a través del filtro EcoCloth™ únicamente. Se tomaron imágenes de placas de colonias utilizando el escáner fotográfico Epson Perfection V600 con el software Epson Scan Utility v3.9.2.0.

Se sometieron tres cultivos replicados de formas L de 1, 3 y 7 días de edad o protoplastos recién preparados a un ensayo de tinte Laurdan como medida de la fluidez de la membrana23. Primero se centrifugó aproximadamente 1 ml de cada cultivo a 1000 xg durante 10 minutos para eliminar cualquier rastro del medio de cultivo. Las células se resuspendieron en 1 ml de tampón P y se ajustaron a una DO600 de 0,6. Se preparó una solución madre de Laurdan (6-dodecanoil-2-dimetilaminonaftaleno, D250, Invitrogen) 10 mM en dimetilformamida al 100% (DMF, D4551, Sigma-Aldrich) y se almacenó a -20 °C en un tubo de color ámbar. A cada 1 ml de cultivo ajustado por DO, se añadió 1 µl de colorante Laurdan hasta una concentración final de 10 µM. Luego los cultivos se incubaron en la oscuridad a 30 °C durante 10 min, mientras se agitaban a 100 rpm. Las células se lavaron tres veces con tampón P que contenía dimetilsulfóxido al 1% (DMSO, 41639, Sigma-Aldrich) para eliminar las moléculas de tinte no unidas antes de resuspender las células en tampón P. Se dividieron alícuotas de aproximadamente 200 µl de este cultivo resuspendido en un SensoPlate™ de fondo negro/vidrio de 96 pocillos (655892, Greiner Bio-One). Se midieron tres réplicas técnicas por cultivo, así como una réplica por condición de cultivo sin tinte para medir la fluorescencia de fondo.

La excitación de la muestra se realizó a 350 nm seguida de la captura por emisión de fluorescencia a 435 y 490 nm, determinada utilizando un lector de microplacas multimodo Spark® (Tecan) con el software Sparkcontrol V3.1. Después de restar la fluorescencia de fondo, se calculó el valor de polarización generalizada (GP) utilizando la ecuación. (1):

Los valores obtenidos después del cálculo se encuentran en el rango de −1 a +1 y aquellos más cercanos a −1 indican una mayor fluidez.

La preparación de células para la cuantificación de la fluidez de la membrana mediante microscopía se realizó de la siguiente manera. Las células se lavaron y se ajustó la DO como se mencionó anteriormente. Se añadió tinte Laurdan (concentración madre 10 mM) a 100 µl de cultivo para obtener una concentración final de 100 µM. El cultivo se colocó a 30 °C durante 5 min, mientras se agitaba a 100 rpm en oscuridad. Se añadieron aproximadamente 900 µl de tampón P precalentado que contenía DMSO al 1% y el cultivo se centrifugó (1000 xg, 10 min) para eliminar cualquier molécula de tinte no unida. Finalmente, las células se resuspendieron en 100 µl de tampón P para análisis microscópico. Las células tratadas de manera similar pero sin tinte Laurdan se usaron como control para las mediciones microscópicas.

El ADN plasmídico marcado con fluorescencia se preparó utilizando el kit de etiquetado Mirus Label IT® Cy™5 (MIR 2725) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se almacenaron alícuotas de ADN marcado (100 ng µl-1) a -20 °C hasta su uso posterior.

Todos los lípidos (DLin-MC3-DMA76; Colesterol, C8667, Sigma-Aldrich; Avanti Polar Lipids: DSPC, 850365, DMG-PEG2000, 880151, 18:1 Liss Rhod PE, 810150) se combinaron en una proporción molar de 50/38,3. /10/1,5/0,2 utilizando soluciones madre (100 µM–10 mM) en cloroformo:metanol (mezcla 1:1 de cloroformo, 22706, VWR Chemicals y metanol, 83638, VWR Chemicals). Los disolventes orgánicos se evaporaron bajo una corriente de nitrógeno y el disolvente restante se eliminó al vacío durante al menos 1 h. Posteriormente, la película lipídica se disolvió en EtOHabs (20821, VWR Chemicals) y se preparó un tampón citrato 50 mM (pH = 4, MilliQ; usando ácido cítrico, C0759, y citrato tribásico deshidratado de sodio, C7254; Sigma-Aldrich). Cada solución se cargó en jeringas separadas y se conectó a un mezclador de microfluidos con unión en T. Las soluciones se mezclaron en una relación de flujo de 3:1 de tampón citrato frente a lípidos (1,5 ml min-1 para tampón citrato, 0,5 ml min-1 para soluciones lipídicas), dando una concentración total de lípidos de 1 mM. Después de mezclar, la solución se cargó directamente en un casete de diálisis MWCO de 10k (Slide-A-Lyzer™, Thermo Scientific) y se dializó durante la noche frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x, que contenía NaCl 137 mM (NAC02, Formedium), 2,7 mM. KCl (1,04936, VWR Chemicals), Na2HPO4 8 mM (1,06586, VWR Chemicals) y KH2PO4 2 mM (60229, Sigma-Aldrich), durante la noche. Las nanopartículas lipídicas (LNP-LR) están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Todas las incubaciones con LNP se realizaron con células resuspendidas en medio LPB, del cual el volumen final de solución de LNP fue del 25%.

Las preparaciones de nanopartículas lipídicas se caracterizaron de la siguiente manera (Tabla complementaria 8). Las mediciones de dispersión dinámica de la luz (DLS) se realizaron en un Zetasizer Nano Series S (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). El láser HeNe incorporado funciona con una longitud de onda de 633 nm y utiliza un detector en un ángulo de 173° (tecnología de retrodispersión no invasiva). Las mediciones se registraron con un tiempo de equilibrio de 1 min en cubetas UV a 25 °C. Para la estimación del diámetro promedio z (diámetro medio del peso de intensidad) y el índice de polidispersidad (PDI) (ancho relativo de la distribución del tamaño de partícula), las muestras se prepararon mediante dilución diez veces con PBS 1x. Para estimar el potencial zeta, la muestra se diluyó con 0,1 × PBS y se midió en un Zetasizer Nano Series SZ (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Todos los datos estaban por triplicado para obtener el valor medio.

La detección de la emisión de fluorescencia de los transformantes se realizó usando un Zeiss Axioscope A.1 equipado con una cámara digital en color Zeiss Axiocam 305, usando un conjunto de filtros 63 HE (Carl Zeiss, que consiste en un filtro de excitación de paso de banda de 572/25 nm, un divisor de haz de 590 nm y un divisor de haz de 629 nm. /filtro de emisión de paso de banda de 62 nm) para capturar la fluorescencia de mCherry. Se tomaron imágenes de colonias individuales utilizando un Zeiss SteREO Discovery v. 8 equipado con un anillo de luz Schott VisiLED S80-55 y Bresser MikroCam SP5.0. Se utilizó el software Bresser MikroCamLabII para capturar imágenes. El resto de la microscopía se realizó utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 900 con módulo Airyscan 2, cámara de control de temperatura y software Zeiss Zen 3.1 (edición azul, Carl Zeiss Microscopy GmbH) a menos que se especifique lo contrario. Todas las configuraciones de excitación y emisión para este microscopio se enumeran en la Tabla complementaria 7. Se obtuvieron imágenes multicanal (DIC y fluorescencia) y multipila a menos que se especifique lo contrario. Se tomaron imágenes de 10 µl de células en un portaobjetos de 8 cámaras (ibidi®) recubierto con poli-L-lisina al 0,1% (p/v) (P8920, Sigma-Aldrich; se eliminó el exceso de poli-l-lisina y se permitió que el portaobjetos secar antes de aplicar la muestra). Para obtener imágenes en lapso de tiempo o incubación durante la noche en la cámara de control de temperatura, se agregaron 400 μl de cultivo celular a un μ-Dish de imágenes de 35 mm (ibidi®) y se dejaron reposar a 30 °C durante una hora antes de obtener imágenes durante la noche. El análisis de imágenes se realizó utilizando el software Fiji (ImageJ)77.

El ADN cromosómico se visualizó después de una incubación durante 30 minutos con SYTO 9 (S34854, Invitrogen) a una concentración final de 2 μM. Las membranas celulares se visualizaron mediante incubación con SynapseRed C2M (SynapseRed, PK-CA707-70028, PromoKine, PromoCell GmbH) a una concentración final de 40 μg ml-1. Después de una incubación durante la noche en un μ-Dish (ibidi®) usando la cámara confocal de control de temperatura Zeiss LSM 900, se tomaron imágenes de las células usando el modo Airyscan con procesamiento posterior a la imagen de súper resolución a través del software Zen. Los protoplastos y las células S se incubaron con SynapseRed hasta 72 h antes de obtener imágenes en un portaobjetos de vidrio. La cuantificación de supuestas vesículas internas se realizó después de incubar formas L de 7 días de edad (alfa pRed*) o células S y protoplastos recién cosechados (K. viridifaciens pRed*) que producen mCherry citoplásmico con SynapseRed durante 0 o 72 h. SYTO 9 se añadió directamente antes de obtener imágenes para identificar el ADN. Las células se colocaron en un portaobjetos de ocho cámaras (ibidi®) recubierto con poli-l-lisina al 0,1%. Se tomaron imágenes de las formas L y de las células S de arriba a abajo con un tamaño de paso de 0,5 μm y de los protoplastos con un tamaño de paso de 0,28 μm para tener en cuenta su tamaño celular más pequeño. Las células que tenían una o más regiones que carecían de tinción con mCherry, SYTO 9 o SynapseRed se contaron como una célula con una supuesta vesícula interna utilizando el complemento Cell Counter en Fiji (ImageJ).

La absorción de ADN marcado con fluorescencia se evaluó incubando células con ADN plasmídico marcado con Cy5 (pFL-ssgB) a una concentración final de 1,25 μg ml-1 y se tomaron imágenes en un μ-Dish (ibidi®) después de 72 h.

Para capturar la formación de vesículas internas y la absorción de Dextran-Texas Red (D-TR, D-3329, 3000 MW, neutro, Molecular Probes), se incubaron células de alfa pKR2 con una concentración final de 1 mg ml-1 D-TR en PBS y se tomaron imágenes durante la noche. Se realizaron imágenes de pilas múltiples a lo largo de una distancia total de 6 μm con pasos de 1,5 μm con una imagen capturada cada 10 minutos. Se realizaron imágenes de la captación de D-TR en formas L, protoplastos o células S después de una incubación de hasta 72 h. La cuantificación del porcentaje de células que habían absorbido D-TR se realizó de la siguiente manera. Las células que producen eGFP citoplasmática se incubaron con PBS o 1 mg ml-1 D-TR por duplicado durante 72 h (alfa pIJ82-GFP de 7 días o células S o protoplastos recién cosechados de K. viridifaciens pIJ82-GFP). Las células se diluyeron diez veces en medio LPB y se centrifugaron suavemente durante 10 minutos a 1000 xg, después de lo cual el sobrenadante se reemplazó por medio LPB. Las células se colocaron en un portaobjetos de ocho cámaras (ibidi®) recubierto con poli-l-lisina al 0,1%. Las imágenes de pila Z se adquirieron de arriba a abajo de las celdas con pasos de 0,28 μm. Las células con supuesta captación de D-TR se identificaron como aquellas que carecían de una región de eGFP citoplasmática (supuesta vesícula interna), mientras que revelaron un aumento de la emisión de D-TR en esta región, medida con la herramienta Plot Profile en Fiji (ImageJ). Las células con y sin captación se contaron utilizando el complemento Cell Counter en Fiji (ImageJ).

La absorción de LNP fluorescentes rojos (LNP-LR) por alfa se visualizó mediante imágenes después de una incubación durante la noche en un μ-Dish (ibidi®) o después de una incubación durante hasta 3 días antes de la obtención de imágenes, como se indica. La inhibición de la absorción de LNP se realizó mediante incubación en presencia de azida sódica 1, 2,5 o 10 mM (S-8032, Sigma-Aldrich) o incubación a 4 °C, y las imágenes se obtuvieron mediante el software Zen después de 0, 24, y 48h. Para determinar la localización subcelular de LNP-LR en alfa pIJ82-GFP, las imágenes se realizaron utilizando el modo Airyscan con procesamiento posterior a la imagen de superresolución y se analizaron utilizando la intensidad de píxeles de los canales rojo (LNP-LR) y verde (eGFP). utilizando la herramienta Plot Profile en Fiji (ImageJ).

Para medir la fluidez de la membrana, se excitaron muestras utilizando un láser de 405 nm y se capturaron imágenes con emisiones de 430 y 500 nm. El valor de GP se calculó utilizando el complemento Calcular GP en Fiji78 para obtener un histograma de recuentos de píxeles en el rango de −1 a +1. Brevemente, la imagen se divide en canales individuales, seguido de la resta del fondo y el establecimiento de los píxeles no significativos en cero. Luego, a las imágenes se les asignan las letras A y B para calcular A - B y A + B usando la calculadora de imágenes. Finalmente, una relación de (A − B)/(A + B) se muestra como una imagen donde los valores mínimos de píxeles se establecen en −1 (rojo) y los valores máximos de píxeles se establecen en +1 (azul). Utilizando la función de análisis de histograma, se obtiene una lista de valores y se utiliza para trazar las distribuciones de diferentes muestras.

Para capturar la disrupción de las vesículas, las formas L se resuspendieron en LPB fresco hasta una DO600 de 0,04. Las diluciones se colocaron en una SensoPlate de 96 pocillos con fondo negro/vidrio y se centrifugaron suavemente durante 5 minutos a 1000 xg para sedimentar las células en el fondo de los pocillos. Se tomaron imágenes de las células usando un microscopio automatizado Lionheart FX (BioTek) con el software Gen 5 v.3.10 con un aumento de aire de 60 × (brightfield y mCherry usando un cubo de filtro Texas Red 586/647). Las imágenes de pila Z se capturaron cada 15 minutos con un tamaño de paso de 1 µm que cubre un total de 12 µm durante 20 h (Película complementaria 5) o un tamaño de paso de 0,5 µm que cubre un total de 5 µm durante 17,5 h (Películas complementarias 6, 7).

La cepa alfa pIJ82-GFP en forma L de siete días de edad que expresa eGFP citoplásmica se ajustó a una DO600 de 2 en medio nuevo que contenía PBS al 25 % (v/v) y una concentración final de sacarosa al 17 % (p/v). Las células se incubaron durante 4 días, durante los cuales las células se depositaron en el fondo. Se intercalaron unos pocos microlitros del sedimento en forma de L resuspendido entre portadores HPF (congelación a alta presión) con un diámetro interno de 2 mm (cavidad de 0,1 mm o 0,05 mm, Art. 241 y Art. 390 respectivamente, Wohlwend) y se colocaron a medida. FinderTOP de lados planos con etiqueta de rejilla (etiqueta de plaquetas de aluminio, 0,3 mm, Art.1644 Wohlwend) para permitir una impresión de una matriz de buscador en el hielo amorfo79. El finderTOP se trató con 1% de l-α-fosfatidilcolina (61755, Sigma-Aldrich) en etanol (1.00983.1000, Supelco) antes de congelarlo. Luego, las muestras se congelaron a alta presión (Live µ, CryoCapCell) y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta la obtención de imágenes.

Para mejorar la correlación entre la microscopía crioeléctrica y crioelectrónica, las muestras congeladas se cargaron en un soporte criogénico universal (Art. 349559-8100-020, kit de accesorios criogénicos de Zeiss) utilizando la solución ZEISS Correlative Cryo Workflow, que se ajusta al PrepDek® (PP3010Z, Quorum technologies, Laughton, Reino Unido). Aquí, los portadores de HPF encajan en un soporte criogénico universal, que posteriormente se puede colocar en un adaptador específico para microscopía crioeléctrica o crioelectrónica.

Se tomaron imágenes de las muestras congeladas con un adaptador de etapa criogénica (CMS-196, Linkam Scientific inc.) aplicado a un microscopio confocal vertical (LSM 900, Zeiss microscopy GmbH) equipado con un detector Airyscan 2. Se realizaron imágenes generales (Zeiss C Epiplan-Apochroma 5×/0,2 DIC) con microscopía de reflexión para visualizar el patrón cuadriculado en la superficie del hielo. A continuación, se tomaron imágenes de pila Z de resolución media (Zeiss C Epiplan-Apochroma 10 ×/0,4 DIC) con un láser de 488 nm (0,4%) con un tamaño de vóxel de 0,15 µm × 0,15 µm × 1,18 µm. Utilizando esta resolución, se pudieron seleccionar las células de interés y se crearon imágenes de pila Z (Zeiss C Epiplan-Neofluar 100x/0,75 DIC) utilizando un láser de 488 nm (4%), con un tamaño de vóxel de 0,08 µm × 0,08 µm × 0,44 µm. Además, se tomaron imágenes de la superficie del hielo en todas las regiones de interés con microscopía de reflexión para fines de correlación en el FIB-SEM.

Antes de las imágenes con luz criogénica, se creó un proyecto Zeiss ZEN Connect (software Zeiss para microscopía correlativa, versión 3.1) para crear una hoja de trabajo (lienzo) para alinear y superponer todas las imágenes y facilitar una mayor correlación con crio-FIB-SEM. .

La muestra se recubrió con platino, corriente de 5 mA durante 30 s, utilizando el recubridor por pulverización de la etapa de preparación (PP3010, Quorum technologies, Laughton, Inglaterra) y se transfirió al Zeiss Crossbeam 550 FIB-SEM (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Oberkochen). , Alemania) utilizando la cámara de preparación PP3010T (Quorum, Laughton, Inglaterra). Durante todas las tomas de imágenes, las muestras se mantuvieron a -140 °C y la presión de vacío del sistema fue de 1 × 10-6 mbar.

Después de insertar la muestra en la cámara FIB-SEM, se tomaron imágenes generales utilizando el SEM para alinear los datos con la imagen de reflexión LSM de la superficie del mismo proyecto ZEN Connect. Esta alineación permite el registro de etapa, lo que permite utilizar la señal de fluorescencia para navegar a diferentes regiones de interés. Después de la alineación inicial utilizando el SEM, se recopiló una imagen FIB de la superficie con la sonda de 30 kV a 10 pA con una inclinación de 54°.

Se fresa una zanja gruesa para la observación SEM utilizando la sonda FIB de 30 kV a 30 nA. La deposición en frío se realizó con platino durante 30 s. El fresado fino FIB en la sección transversal se realizó utilizando la sonda de 30 kV a 700 pA. Para el fresado FIB en serie y las imágenes SEM, el ancho del corte (zanja) fue de 40 μm y para el fresado FIB se utilizó la sonda de 30 kV a 300 pA, con un espesor de corte de 20 nm. Cuando se expuso una nueva superficie de corte mediante fresado FIB, se recogieron simultáneamente imágenes secundarias de InLens y EsB a un potencial de aceleración de 2,33 kV con una corriente de sonda de 250 pA. La cuadrícula EsB se configuró en −928 V. El tamaño de la imagen se configuró en 2048 × 1536 píxeles. Para la reducción de ruido se utilizó el promedio de líneas con un recuento promedio de líneas N = 46 a la velocidad de escaneo 1. El tamaño del vóxel de todas las pilas fue de 5 nm3 × 5 nm3 × 20 nm3.

Las imágenes crio-FIB-SEM se procesaron utilizando MATLAB (R2018b, Natick, Massachusetts: The MathWorks Inc.) para corregir defectos como cortinas, desalineación y carga local. Se utilizó el mismo software para la posterior reducción de ruido y mejora del contraste. Un resumen de cada paso del procesamiento es el siguiente:

La eliminación de las franjas verticales en las pilas se realizó siguiendo un enfoque de filtrado wavelet-FFT80. En resumen, la información de alta frecuencia correspondiente a las franjas verticales se condensó sucesivamente en un único mapa de coeficientes mediante descomposición mediante la familia de ondas coif. Posteriormente, se realizó una transformada de Fourier 2D para ajustar aún más la información de la franja en bandas estrechas. Finalmente, la información condensada del estípite se eliminó mediante multiplicación con una función de amortiguación gaussiana y la imagen destripada se reconstruyó mediante transformada wavelet inversa.

Los cortes consecutivos se alinearon mediante correlación cruzada normalizada. Brevemente, se eligió la primera imagen de la pila como referencia y la segunda imagen se tradujo píxel a píxel a través de la referencia y se obtuvo una matriz de correlación cruzada normalizada utilizando la función normxcorr2. Luego se utilizó la ubicación del pico más alto en la matriz de correlación cruzada (que representa la mejor correlación) para calcular la traducción requerida para alinear las dos imágenes. Una vez que la imagen en movimiento se alineó con la imagen de referencia, sirvió como referencia para la alineación del corte posterior.

La eliminación del desequilibrio de carga local se logró mediante la resta de fondo gaussiana anisotrópica. Brevemente, se utilizó la función imgaussfilt para realizar un suavizado gaussiano 2D con un vector de desviación estándar de dos elementos. Los elementos del vector se eligieron de manera que se aplicara una gaussiana amplia y nítida en las direcciones horizontal y vertical, respectivamente. Posteriormente se obtuvo la imagen corregida restando la imagen filtrada de la imagen original.

Para mejorar la relación señal-ruido, la reducción del ruido se realizó mediante filtrado de difusión anisotrópica81. Brevemente, utilizando la función imdiffuseest, se estimó el umbral de gradiente óptimo y el número de iteraciones necesarias para filtrar cada imagen. Posteriormente, se aplicó la función imdiffusefilt con los valores de parámetros óptimos estimados para eliminar el ruido de cada imagen.

Como paso final de procesamiento, el contraste se mejoró mediante la ecualización de histograma adaptativa limitada por contraste82. Utilizando la función adapthisteq, el contraste se mejoró en dos pasos, utilizando una distribución uniforme y un límite de recorte bajo para evitar la sobreamplificación de regiones homogéneas.

Se utilizó el software de análisis de imágenes y aprendizaje profundo DragonflyTM (versión 2021.1, Objects Research Systems, Montreal, QC, Canadá) para segmentar todos los datos de las imágenes.

Secuencias de proteínas de Bacillus subtilis str. 168, Neisseria gonorrhoeae y la cepa P12 de Helicobacter pylori se obtuvieron de la base de datos o la literatura de UniProt y se proporcionan en los Datos complementarios 1. La proteína BLAST se ejecutó para estas secuencias con la base de datos de secuencias codificantes traducidas de la cepa DSM40239 de Streptomyces viridifaciens (también conocida como K. viridifaciens cepa DSM40239), con números de acceso de secuencia CP090840, CP090841 y CP090842, utilizando el software BLAST fuera de línea (v. 2.12.0). Se recogieron aciertos con un valor E de 1 × 10-6 o inferior (Tabla complementaria 1).

Todas las estadísticas se indican y se realizaron utilizando el software estadístico SPSS (IBM, versión 27.0), excepto la prueba z de dos proporciones, que se calculó manualmente. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los supuestos de la prueba se determinaron utilizando los siguientes métodos. La homogeneidad de las varianzas se probó mediante la prueba de Levene. La normalidad se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov, la prueba de Shapiro-Wilk y los gráficos QQ, cuando correspondía. Los gráficos se generaron con Graphpad Prism v. 9.0.0 o con R versión 3.6.1, y otras imágenes gráficas se generaron con Adobe Illustrator v. 26.3.1 o mediante Biorender.com (consultado en agosto de 2022). Las desviaciones estándar se calcularon y representaron mediante Graphpad Prism.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Las secuencias de proteínas obtenidas de la base de datos UniProt o de la literatura para realizar la búsqueda NCBI BLAST se proporcionan con números de acceso en Datos complementarios 1. Todas las micrografías de fluorescencia y FIB-SEM en este documento, incluidos los datos FIB-SEM sin procesar subyacentes a la representación del volumen de segmentación 3D ( Las películas complementarias 3, 4), así como las micrografías utilizadas para la cuantificación de la absorción de vesículas y D-TR en la Fig. 3f y las Tablas complementarias 2 y 3, se han depositado en la base de datos Open Science Framework (OSF) disponible en https:// doi.org/10.17605/OSF.IO/5WKGJ. Para la búsqueda BlastP, se recopilaron resultados de la cepa DSM40239 de Streptomyces viridifaciens con números de acceso CP090840, CP090841 y CP090842. Se utilizó Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (acceso CP023698 para deducir el supuesto codón de inicio y parada comEC de K. viridifaciens para la construcción de desactivación genética. Los datos originales se proporcionan con este artículo.

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Correspondencia a Gilles P. van Wezel o Dennis Claessen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Angel Manteca, Katarzyna Mickiewicz y otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

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Kapteijn, R., Shitut, S., Aschmann, D. et al. Captación de ADN similar a la endocitosis por bacterias con deficiencia de pared celular. Nat Comuna 13, 5524 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33054-w

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Recibido: 16 de febrero de 2022

Aceptado: 31 de agosto de 2022

Publicado: 22 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33054-w

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