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Nature Communications volumen 13, número de artículo: 2919 (2022) Citar este artículo

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Los biosensores fluorescentes codificados genéticamente son herramientas poderosas que se utilizan para rastrear procesos químicos en sistemas biológicos intactos. Sin embargo, el desarrollo y la optimización de biosensores sigue siendo un proceso desafiante y que requiere mucha mano de obra, principalmente debido a las limitaciones técnicas de los métodos para seleccionar biosensores candidatos. Aquí describimos una modalidad de detección que combina microfluidos de gotas e imágenes de fluorescencia automatizadas para proporcionar un aumento de orden de magnitud en el rendimiento de la detección. Además, a diferencia de las técnicas actuales que se limitan a la detección de una única característica del biosensor a la vez (por ejemplo, brillo), nuestro método permite la evaluación de múltiples características (por ejemplo, contraste, afinidad, especificidad) en paralelo. Debido a que las características del biosensor pueden covariar, esta capacidad es esencial para una optimización rápida. Utilizamos este sistema para generar un biosensor de lactato de alto rendimiento que puede usarse para cuantificar las concentraciones de lactato intracelular. Este biosensor, llamado LiLac, constituye un avance significativo en la detección de metabolitos y demuestra el poder de nuestro enfoque de detección.

Los biosensores fluorescentes codificados genéticamente son herramientas importantes para estudiar el metabolismo. Su señal fluorescente proporciona una alta resolución temporal, tanto en escalas de tiempo rápidas como durante imágenes crónicas1,2,3,4,5, y debido a que están codificadas genéticamente, pueden expresarse directamente en células vivas y dirigirse a tipos de células y orgánulos específicos6,7 . Como las células individuales pueden ser metabólicamente distintas y los metabolitos se renuevan a un ritmo rápido8,9, los biosensores han permitido de manera única mediciones precisas en células individuales de los estados metabólicos basales y las perturbaciones metabólicas en respuesta a un desafío o estímulo1,10.

Para cuantificar las concentraciones de metabolitos, la lectura de un biosensor fluorescente debe i) ajustarse a las concentraciones fisiológicas del ligando objetivo, ii) ser altamente específica para ese ligando y iii) ser robusta frente a los cambios en el entorno celular (incluido el pH) y el nivel de expresión. del propio biosensor. La única forma de desarrollar biosensores de alto rendimiento es detectarlos, analizando muchas variantes individuales de grandes bibliotecas de biosensores, ya que están expuestos a muchas concentraciones y condiciones de ligandos.

Esto plantea un desafío para la detección de biosensores. A pesar de los impresionantes avances en la ingeniería de nuevas plataformas para la evolución de proteínas fluorescentes y biosensores7,11,12,13,14, las pantallas existentes todavía están limitadas en la cantidad de condiciones que se pueden probar con el biosensor. Aquí hemos superado estas limitaciones, aumentando el contenido de detección y el rendimiento en órdenes de magnitud, mediante la combinación de microfluidos de gotas e imágenes automatizadas de fluorescencia de dos fotones durante la vida útil (2p-FLIM). La vida útil de la fluorescencia es el tiempo promedio entre la absorción y la emisión de fotones, y los sensores de vida útil han surgido como herramientas de alto rendimiento para cuantificar los niveles de moléculas pequeñas en células intactas7,15,16. Aquí hemos explotado geles semipermeables producidos mediante microfluidos, llamados perlas de cubierta de gel (GSB)17 que sirven como cámaras de diálisis a microescala y los hemos utilizado para analizar miles de variantes de sensores de por vida aisladas independientemente frente a muchas condiciones diferentes, evaluando simultáneamente la afinidad, la especificidad y la respuesta. tamaño.

También mostramos cómo nuestro sistema de detección, BeadScan, se puede utilizar para desarrollar y optimizar rápidamente biosensores fluorescentes codificados genéticamente. Como demostración de las capacidades de nuestra pantalla, utilizamos BeadScan para generar un sensor de lactato de por vida de alto rendimiento, llamado LiLac. El lactato es un producto clave de la glucólisis que recientemente se ha apreciado como un importante combustible celular que circula en la sangre, un medio para comunicar el estado redox entre células y tejidos, y un combustible preferido para ciertos tipos de cáncer18,19,20. Los biosensores de lactato existentes se han utilizado para investigar el metabolismo en el cerebro y en las células cancerosas21,22,23,24,25,26, pero cada uno tiene limitaciones que dificultan la cuantificación (por ejemplo, sensibilidad débil a los cambios fisiológicos en el lactato o respuestas indeseables al calcio). y/o pH). LiLac exhibe un gran tamaño de respuesta (cambio de vida de 1,2 ns y un cambio de intensidad > 40 % en células de mamíferos), especificidad por el [lactato] fisiológico y resistencia al calcio o cambios en el pH. Además, la respuesta de vida de LiLac es muy precisa y no requiere normalización, lo que facilita la cuantificación de las concentraciones de lactato en células vivas. Por lo tanto, LiLac constituye una poderosa herramienta para estudiar el metabolismo a nivel unicelular y demuestra las ventajas de nuestro enfoque de detección.

Los GSB son microvasos ideales para analizar biosensores en una serie de condiciones muy variadas, como una curva dosis-respuesta o un ensayo de especificidad. Sus capas semipermeables intercambian solutos por debajo de 2 kDa17, lo que les permite retener el ADN y la proteína biosensora mientras pasan moléculas pequeñas como los analitos objetivo de los quimiosensores. Descubrimos que los GSB se adhieren naturalmente a los cubreobjetos de vidrio limpios, presumiblemente debido a la adhesión entre las cargas positivas expuestas en la "cáscara" y la carga negativa del vidrio. Al obtener imágenes de GSB que contienen proteína biosensora prepurificada, la fluorescencia del biosensor se puede medir en una serie de condiciones intercambiando soluciones alrededor de los GSB adherentes (Fig. 1a-d). Este formato de ensayo es más conveniente para probar un conjunto diverso de condiciones que los microcapilares o las placas de ensayo multipocillo. Podemos utilizar este enfoque para medir las respuestas de los biosensores a analitos como ATP o NADH, lo que demuestra que las capas de polielectrolitos de los GSB permiten el paso incluso de estas biomoléculas de tamaño moderado con múltiples cargas.

Una caricatura de un GSB que contiene ADN plasmídico y una proteína biosensora fluorescente. Un núcleo de gel de agarosa se envuelve en una cubierta de polielectrolito con un límite de peso molecular informado de ~2 kDa17. b Un único GSB de 20 μm dopado con un biosensor fluorescente verde, campo claro (izquierda) y epifluorescencia (derecha), barra de escala de 5 μm. c Curva de respuesta a la dosis de Peredox, un sensor de vida útil de fluorescencia que responde a NAD+/NADH1,47, adquirida a pH 7,3 a 34 °C en proteína biosensora purificada encapsulada en GSB (media ± DE). Se utilizó lactato deshidrogenasa (LDH) purificada más lactato y piruvato para establecer la relación NAD+/NADH fuera de los GSB, siguiendo métodos previamente establecidos para Peredox47. LDH no ingresa a los GSB. d Tira de película de las imágenes de fluorescencia de vida útil utilizadas para generar los datos en (c), pseudocoloreadas de acuerdo con el mapa de calor de vida útil a la derecha y organizadas en orden de lactato/piruvato (L/P). Barra de escala de 30 μm. Esquema general del BeadScan. Los plásmidos individuales de una biblioteca de biosensores se aíslan en gotitas de microfluidos que sirven como cámaras de reacción del tamaño de un picolitro para la amplificación basada en PCR. Los amplicones clonales se inmovilizan en perlas de afinidad introducidas en cada gota, lo que finalmente produce una biblioteca de perlas de ADN clonal. Luego, las perlas individuales se vuelven a encapsular en nuevas gotitas que contienen reactivos de transcripción/traducción in vitro (IVTT) para la expresión del biosensor. Las gotitas de IVTT que contienen un biosensor maduro se convierten luego en perlas de gel semipermeables (GSB). Se colocan hasta 10 000 GSB en un cubreobjetos de vidrio para obtener imágenes y análisis de fluorescencia automatizados. Los GSB individuales que muestran propiedades biosensoriales favorables se recolectan mediante una micropipeta y los genotipos se recuperan de la perla de ADN mediante PCR y secuenciación de Sanger.

El uso de GSB para una detección de muchas variantes de biosensores requiere atrapar una sola especie de ADN y su proteína biosensora derivada en GSB individuales, con una concentración suficientemente alta de proteína biosensora para analizar la fluorescencia (generalmente en el rango micromolar para proteínas fluorescentes). Anteriormente, los GSB se habían utilizado para la selección de enzimas evolucionadas mediante la captura y lisis de bacterias individuales que expresaban variantes enzimáticas17. Las enzimas se encuentran a niveles nanomolares en los GSB y su actividad se visualiza con sustratos fluorogénicos; pero sin la ventaja de la amplificación enzimática en el ensayo, los biosensores fluorescentes son difíciles de detectar en estas bajas concentraciones.

Para superar este problema, desarrollamos una estrategia optimizada para la expresión micromolar de variantes de biosensores individuales en compartimentos GSB individuales (Fig. 1e), utilizando ADN inmovilizado con microperlas para impulsar la expresión en un sistema de transcripción/traducción acoplada in vitro (IVTT) (Suppl. Figura 1). En primer lugar, se aíslan en gotitas moléculas de ADN individuales de una biblioteca de variantes y se amplifican mediante PCR. A continuación, cada conjunto clonal de ADN amplificado se captura en microperlas de poliestireno mediante un enlace biotina-estreptavidina. Estas perlas de ADN clonal se utilizan luego para impulsar reacciones IVTT individuales en gotitas, que posteriormente se convierten en GSB. Esta serie de pasos se logra mediante el uso secuencial de formación de gotas de agua en aceite de microfluidos y pasos de electrofusión de gotas (Fig. 2) y produce GSB con niveles de expresión de proteínas ~1000 veces más altos que el método publicado anteriormente. La conversión de una biblioteca de ADN de biosensor en ~105 GSB se puede realizar en 2 días, y es posible detectar ~10 000 variantes en una semana.

a El ADN de la biblioteca diluida se mezcla con reactivos de PCR de inicio en caliente y se emulsiona utilizando un generador de gotas de microfluidos, de modo que la mayoría de las gotas contengan 1 o 0 copias de ADN. Todas las gotas tienen cebadores 5'-TexasRed-Forward (pegar con un punto rosa) y 5'-Biotin-Reverse (pegar con un doble pentágono abierto), de modo que los amplicones llevan una etiqueta TexasRed en la cadena sentido y una etiqueta de biotina en la cadena antisentido. . Las gotas con ADN amplificado se teñirán con SYBR Green, agregado a una alícuota de diagnóstico de la emulsión. b El ADN biotinilado se captura en perlas de estreptavidina mediante la fusión microfluídica controlada de gotitas de PCR con gotitas que contienen perlas. Las gotitas de PCR se reinyectan en un dispositivo de microfluidos, mientras que una suspensión de perlas de estreptavidina se emulsiona en el chip. Los pares de gotas se fusionan activamente (>80 % de eficiencia) a medida que pasan por un campo localizado generado por un electrodo (10 kHz, 0,5 kV), momento en el que las perlas capturan el ADN amplificado. c La adición de perfluorooctanol (PFO) rompe la emulsión, que se separa en una fase acuosa que contiene las perlas y una fase oleosa. Luego, las perlas se lavan para eliminar el ADN residual no unido. d La biblioteca de perlas de ADN se vuelve a encapsular en nuevas gotas junto con reactivos de transcripción/traducción in vitro (IVTT) utilizando un dispositivo de microfluidos personalizado que combina las dos corrientes acuosas inmediatamente antes de la emulsificación, mitigando la transcripción prematura y la contaminación cruzada del ARNm. Sólo las gotas que contienen una perla de ADN expresarán la proteína biosensora fluorescente después de una incubación durante la noche a 30 °C. e Finalmente, las gotas de IVTT se convierten en GSB semipermeables duraderos mediante la fusión controlada de microfluidos con una mezcla de agarosa (gel en sol) y alginato (polianión), seguida de la rotura de la emulsión por PFO en presencia de PAH (policatión). Los dos polielectrolitos forman una capa semipermeable en la superficie de la estructura del gel, atrapando proteínas y ADN dentro del gel pero permitiendo el paso de moléculas pequeñas (<2 kDa)17. El intercambio continuo de ligandos permite la recopilación de curvas dosis-respuesta completas de la proteína biosensora encapsulada en cada gel durante la detección posterior. Las barras de escala representan 20 μm.

El primer paso en el flujo de trabajo es preparar la biblioteca de ADN clonal, con una cantidad suficiente de copias para impulsar una alta expresión de la proteína biosensora en gotitas de IVTT (104–105 copias/gota). Para lograr un alto número de copias de clones individuales, se aíslan copias individuales de ADN en gotitas de microfluidos y se amplifican mediante PCR (PCR en emulsión o emPCR; Fig. 2a). Emulsionar una mezcla de ADN muy diluido asegura que la mayoría de las gotas tengan 1 o 0 copias de ADN. Luego, cada gota de emPCR sirve como cámara de reacción a microescala para la amplificación de la plantilla aislada utilizando reactivos de PCR. Si bien no cuantificamos el número de copias/gota final, una gota de emPCR de 35 μm puede, en teoría, producir millones de copias de ~ 2 kb de ADNbc antes de que se agoten los reactivos.

Debido a que los sistemas IVTT purificados son altamente sensibles a los cambios en las condiciones de reacción, particularmente a la dilución de reactivos, la combinación directa de gotitas de emPCR con gotitas de IVTT de tamaño similar da como resultado una expresión deficiente del sensor. Por lo tanto, optamos por inmovilizar el ADN amplificado en perlas, purificar las perlas de ADN y luego usar un volumen mínimo para entregarlas en gotitas de IVTT, de modo que las gotitas finales de perlas de ADN de IVTT + contengan reactivos de IVTT sin diluir sin arrastre de reactivos de PCR.

Los métodos existentes para producir perlas de ADN primero unen los cebadores a las perlas y luego se amplifican desde la superficie de las perlas. Estos métodos se limitan a ~103 copias/cuenta para amplicones grandes (~1 a 2 kb para un biosensor), presumiblemente debido a la baja eficiencia de la amplificación desde una superficie sólida27,28. En nuestras manos, estos métodos no lograron producir de manera confiable perlas cargadas con un alto número de copias de amplicones de longitud completa; sólo entre el 0,1% y el 1% de las perlas de ADN resultantes fueron capaces de impulsar una fuerte expresión de nuestros sensores objetivo en gotitas de IVTT. Para superar estas limitaciones, permitimos que el ADN molde se amplificara libre en solución en gotitas que contenían un cebador 3' biotinilado y luego inmovilizamos los productos de la PCR en perlas de estreptavidina. Para lograr esto, cada gota de emPCR amplificada se fusiona con una gota emparejada que contiene una perla de afinidad de estreptavidina (Fig. 2b) mediante una fusión de microfluidos activa controlada a una velocidad de ~ 4 a 5 millones de gotas por hora. La perla de estreptavidina captura el ADN biotinilado amplificado, de modo que cada perla está recubierta con muchas copias de un solo clon. Luego, las perlas se liberan de las gotitas y el exceso de ADN se elimina por lavado (Fig. 2c). Con este método, una perla de poliestireno de 6 μm puede capturar >200.000 copias clonales de amplicones de >2 kb y se pueden preparar millones de perlas en paralelo. Sin embargo, la expresión óptima de la proteína sensora soluble se logró con perlas limitadas intencionalmente a ~100.000 copias de ADN mediante el bloqueo previo de un subconjunto de sitios de unión de estreptavidina, porque las perlas cargadas más densamente a veces conducían a la acumulación de agregados de proteínas visibles dentro de la gotita (Suppl. Figura 1c). También optimizamos la concentración del cebador 3' biotinilado incluido en las gotitas de emPCR. Descubrimos que el uso de un exceso de cebador 3' biotinilado produjo malos resultados, presumiblemente porque el cebador 3' biotinilado original no extendido compite con el ADN biotinilado completamente extendido por los sitios de unión de estreptavidina. Por lo tanto, utilizamos una concentración limitante del cebador 3' para asegurar la extensión completa de todas las moléculas del cebador biotinilado, de modo que solo se capturen amplicones completamente extendidos en las perlas de estreptavidina.

Para expresar la biblioteca de biosensores, las perlas de ADN individuales se purifican y se reencapsulan en gotitas que contienen reactivos IVTT utilizando un dispositivo generador de gotitas de coflujo de dos corrientes que introduce perlas en la corriente IVTT inmediatamente antes de la encapsulación de las gotitas (Fig. 2d, Suppl. Figuras 2a-b). Después de probar múltiples sistemas de expresión libres de células, incluidos lisados ​​​​celulares, logramos niveles óptimos de expresión de biosensores con reactivos IVTT purificados, específicamente el sistema PUREfrex2.0 (Supl. Fig. 1).

Una vez que se ha expresado la proteína biosensora, las gotitas de IVTT se transforman en GSB: 1) fusionando gotitas de IVTT individuales con gotitas que contienen una mezcla de agarosa (gel) y alginato (polianión), 2) dispersando las gotitas en una emulsión de policatión (poli( clorhidrato de alilamina, PAH (Fig. 2e, Supl. Fig. 2c-d), luego 3) romper la emulsión mixta para permitir la complejación de los dos polímeros con carga opuesta. Se forma una capa semipermeable en la superficie de la matriz del gel de agarosa, que atrapa la proteína biosensora en su interior pero permite el paso de pequeñas moléculas17. En las pruebas iniciales, observamos una pérdida de entre el 50% y el 60% de la proteína sensora durante el paso final. Si bien la velocidad de formación de la cubierta es indeterminada, suponemos que tras la interrupción de la emulsión, parte de la proteína se difunde fuera del gel antes de que se pueda formar la cubierta. Por lo tanto, incluimos nanoesferas de Ni-NTA en los geles para retener la proteína sensora etiquetada con his6 durante la deposición de la cáscara. Una vez que se ha formado la cubierta alrededor del GSB maduro, la proteína sensora se libera de las nanoesferas con un tratamiento suave con EDTA. Esta modificación mejoró la retención de la proteína sensora desde las gotitas de IVTT hasta los GSB maduros hasta ~90-100%.

En su forma final, cada GSB sirve como una cámara de diálisis a microescala que contiene una variante de biosensor única. Los GSB inmovilizados (~105 GSB en un cubreobjetos de vidrio de 1 cm2) pueden soportar velocidades de flujo >20 ml/min dentro de una cámara de perfusión de microscopía estándar, lo que permite un intercambio rápido de condiciones externas mientras que las respuestas de fluorescencia de los biosensores encapsulados se registran utilizando 2p-FLIM. Después de la detección, se recuperan GSB individuales con un microcapilar y las secuencias de ADN se recuperan mediante amplificación por PCR y secuenciación de Sanger (Supl. Fig. 3).

Debido a que este sistema utiliza perlas de gel para escanear rápidamente bibliotecas de biosensores en busca de propiedades optimizadas, lo hemos llamado BeadScan. Si bien BeadScan se puede utilizar para rastrear cambios en la intensidad de la fluorescencia o la vida útil, descubrimos que las mediciones de la vida útil son más sólidas frente a los efectos acumulativos del fotoblanqueo y producen respuestas de dosis precisas de GSB individuales.

Para demostrar las capacidades de nuestro sistema, nos propusimos generar un biosensor de lactato codificado genéticamente de novo. Un biosensor FRET existente para lactato, Laconic, se ha utilizado para investigar el metabolismo neuronal1,21,29,30, pero su respuesta superficial al lactato y las complicaciones ópticas que surgen del uso de dos fluoróforos hacen que su uso cuantitativo sea un desafío. Los biosensores de fluoróforo único más nuevos, GEM-IL, Green Lindoblum, CanlonicSF y eLACCO1.1 también tienen limitaciones23,24,25,26. GEM-IL responde a los cambios fisiológicos del pH, lo que complica las mediciones precisas del lactato; Green Lindoblum tiene una afinidad muy alta por el lactato fuera del régimen fisiológico; y CanlonicSF y eLACCO1.1 responden tanto al lactato como al calcio, restringiendo su utilidad a compartimentos con niveles saturados de calcio. CanlonicSF y eLACCO1.1 se basan en la proteína periplásmica de unión a lactato y calcio TTHA0766 de T. thermophilus, mientras que todos los demás biosensores de lactato existentes utilizan el factor de transcripción LldR de E. coli y C. glutamicum.

Dado el éxito limitado en la mejora de los biosensores basados ​​en LldR y la sensibilidad al calcio de los biosensores basados ​​en TTHA0766, seleccionamos un andamio no probado para nuestro biosensor: el dominio dCACHE extracelular de la proteína de quimiotaxis bacteriana, TlpC de H. pylori. TlpC es altamente específico para el lactato y no muestra afinidad detectable por ligandos estructuralmente similares como piruvato u oxaloacetato31. Si bien solo se ha resuelto la estructura cristalina unida al ligando del dominio de unión de lactato de TlpC, razonamos que la unión de lactato puede generar un gran cambio conformacional entre los extremos N y C, que están muy cerca31,32. De hecho, el receptor de quimiotaxis estructuralmente similar, TlpA, puede acomodar grandes cambios estructurales de hasta 8 Å entre la hélice del tallo N-terminal y la cadena β C-terminal que se conecta a los dominios transmembrana33. Para aprovechar este movimiento, los extremos N y C de TlpC se conectaron a la proteína verde fluorescente T-Sapphire (Fig. 3a), que ha producido un cambio en la vida útil de la fluorescencia en varios biosensores de un solo color anteriores1,10,15.

a Esquema del diseño del biosensor de lactato. El dominio de unión a lactato de la proteína TlpC se insertó en la proteína fluorescente T-Sapphire. Las regiones enlazadoras flexibles (estrellas amarillas) que conectan los dos dominios se variaron en una gran biblioteca de biosensores, muestreando 49.152 variantes de biosensores. b Se inmovilizaron ~10 000 GSB que contenían la biblioteca de biosensores de lactato TlpC-TS en un cubreobjetos de vidrio de 1 cm2 dentro de una cámara de perfusión. 2196 GSB alcanzaron el umbral mínimo de fluorescencia para la detección de ROI. La imagen unida se recrea a partir de 121 fotogramas individuales grabados con 2p-FLIM. El cuadro blanco marca un solo cuadro (771 μm cuadrados). c Un cuadro que muestra un solo GSB (flecha) que contiene una variante de biosensor que respondió bien al lactato. El biosensor mostró una vida útil de fluorescencia alta con [lactato] bajo y una vida útil baja con [lactato alto]. Los valores de vida útil están pseudocoloreados según el mapa de calor en la parte inferior. Las barras de escala indican 100 μm. d Pantalla inicial de la biblioteca de biosensores de lactato TlpC-TS, que muestra datos de variantes de biosensores individuales capturadas en GSB. Los recuentos medios de fotones dentro de cada ROI se trazan frente al cambio máximo en la vida útil entre 0 y 10 mM de lactato; cada punto de datos representa un único GSB. Se seleccionaron dos GSB con grandes cambios en su vida útil (cuadros de puntos). e Curvas dosis-respuesta de cada uno de los dos GSB individuales indicados en (d). f Rendimiento de TlpC-TS #1059 a cuatro valores de pH diferentes. Se recopilaron curvas de dosis-respuesta en una muestra uniforme de GSB que expresan TlpC-TS #1059 (n = 96 GSB, media ± DE). g Detección multiparamétrica de una biblioteca enlazadora de TlpC-TQ, comparando los cambios de vida en respuesta al lactato frente al pH para cada uno de 1411 GSB individuales. A pesar de una correlación general entre las respuestas inducidas por el lactato y el pH, se pudieron aislar variantes raras que resistieron esta tendencia (#1083). h Respuestas a la dosis de lactato de cada uno de los dos GSB individuales indicados en (g) a pH 6,7 y pH 7,5. La variante resistente al pH (#1083, arriba) pasó a llamarse LiLac. i Las respuestas de LiLac al lactato son altamente resistentes a los cambios en el pH fisiológico. Datos recopilados a temperatura ambiente utilizando una muestra uniforme de GSB que expresan LiLac (n = 90 GSB, media ± DE). En (f, i), algunas barras de error están ocluidas por los puntos de datos.

Debido a que los conectores que conectan la proteína fluorescente y el andamio pueden afectar profundamente la respuesta del biosensor, generamos una biblioteca de variantes del biosensor TlpC-TS que tomó muestras de 49,152 enlaces diferentes, variando tanto en longitud como en composición (Fig. 3a), y seleccionamos esta biblioteca usando BeadScan. (Figuras 3b-c). Aislamos dos biosensores de alto contraste, TlpC-TS #1537 y #1059, que muestran un cambio de vida invertido (|ΔLT | = 0,2 ns y 0,3 ns, respectivamente) con afinidades aparentes (Kapp = 0,19 ± 0,13 mM y 0,66 ± 0,11 mM , respectivamente, Fig. 3d-e) dentro del rango fisiológico del lactato, que circula a 1-2 mM18,20,34. Las concentraciones de lactato intracelular varían ampliamente según los tipos de células y los estados fisiológicos35,36, pero normalmente se espera que estén entre 0,5 y 5 mM.

Tras una caracterización in vitro adicional, encontramos que TlpC-TS era altamente específico para su ligando afín sobre otros ligandos químicamente similares, pero también era sensible a los cambios de pH dentro de rangos fisiológicamente relevantes (Fig. 3f). Muchos biosensores de fluoróforo único responden al pH, incluidos todos los biosensores de lactato antes mencionados, excepto CanlonicSF (que responde al calcio). Debido a que el pH no es constante dentro de las células vivas37, los datos de los biosensores sensibles al pH requieren una interpretación cuidadosa; y si bien es popular calibrar las respuestas de pH con un biosensor nulo, el biosensor ocupado y desocupado a menudo muestra sensibilidades diferentes38,39,40,41,42,43,44,45, lo que hace que este sea un ajuste imperfecto.

Por lo tanto, nos propusimos reducir las respuestas de pH de nuestro prototipo de biosensor de lactato para permitir una cuantificación más precisa de las concentraciones de lactato intracelular. Razonamos que la respuesta del pH puede surgir de la proteína fluorescente T-Sapphire46, y repetimos nuestra biblioteca de enlazadores usando mTurquoise2, un fluoróforo altamente resistente al pH utilizado recientemente para desarrollar un sensor fluorescente de vida útil para los niveles de calcio7, que también es más brillante y más fotoestable. que T-Zafiro7,14,46. Utilizando BeadScan, analizamos la nueva biblioteca (denominada en este documento TlpC-TQ) para detectar respuestas de lactato mejoradas con sensibilidad al pH reducida (Fig. 3g-h).

Para la mayoría de las variantes del biosensor TlpC-TQ, la magnitud de la respuesta del lactato se correlacionó con la de la respuesta del pH (Fig. 3g). Una variante en particular, TlpC-TQ #1297, tuvo la misma respuesta a un cambio en el pH (7,5 a 6,7) que a la adición de lactato 0,1 mM (Fig. 3H). Sin embargo, de 1411 variantes, aislamos con éxito una variante rara, TlpC-TQ # 1083, que mostró grandes respuestas de lactato y una sensibilidad al pH muy disminuida (Fig. 3h-i; Supl. Fig. 4). También exhibió un rango dinámico más amplio con alta sensibilidad a los niveles fisiológicos de lactato (Kapp = 0,62 ± 0,04 mM a pH 7,3 a 24 °C), características que se seleccionaron conjuntamente utilizando nuestra modalidad de detección. A este biosensor de lactato de por vida optimizado lo llamamos LiLac (secuencias de ADN y proteínas en la Nota 1 complementaria).

Caracterizamos los parámetros fotofísicos (Suplemento Fig. 5, Suplemento Tabla 1) y el rendimiento de LiLac con respecto a la especificidad y la temperatura en varios contextos, comenzando con una muestra uniforme de LiLac producida por IVTT en GSB. LiLac es altamente específico para el lactato sobre otros ligandos químicamente similares, incluido el piruvato, así como el calcio (Fig. 4a). La variación total de la vida útil de ~0,8 ns es similar a la de otros sensores de vida útil de alto rendimiento, incluidos Tq-Ca-FLITS y Peredox (~1,3 ns y ~0,8 ns, respectivamente; Fig. 4b)7,47. A temperaturas más altas, el rango dinámico aumenta (~ 1 ns a 34 ° C) mientras que la afinidad del biosensor por el lactato disminuye (Kapp = 2,68 ± 0,15 mM a pH 7,3 a 34 ° C; Fig. 4c).

a Las pruebas de especificidad muestran que LiLac muestra un cambio en la vida sólo cuando se expone al lactato. Una muestra uniforme de GSB que expresaban LiLac se expuso a lactato 10 mM o 1 mM, o 1 mM de cada uno de otros nueve compuestos químicos que pueden interferir con los biosensores de lactato (n = 19 GSB, las barras de error son media ± DE). | ΔLT | (ns) indica la magnitud del cambio de vida útil en relación con el búfer. b Una muestra uniforme de GSB que expresaban LiLac se expuso a diferentes concentraciones de lactato a pH 7,3 a temperatura ambiente (RT, n = 90 GSB) o a c 34 ± 1 °C (n = 21 GSB, media ± DE representada). d Calibración del biosensor realizada en células HEK293T permeabilizadas a 34 ± 1 °C. Las células se permeabilizaron con β-escina en presencia del inhibidor de lactato deshidrogenasa GSK-2837808A (2 µM), luego se tomaron imágenes después de la exposición a diferentes concentraciones de lactato (4 a 12 células por punto de datos, media ± DE). Los recuadros de imágenes de toda la vida de las células en lactato de 0 y 100 mM representan células completamente permeabilizadas (hinchadas). La pseudocoloración refleja valores de vida empíricos según el mapa de calor. Las barras de escala representan 20 μm. e Histogramas de llegada de fotón único resueltos en el tiempo para LiLac expresados ​​en células HEK293T permeabilizadas de (d), en presencia (puntos grises) y ausencia (puntos negros) de lactato, cada uno basado en una imagen de una sola célula promediada en 10 cuadros . Los parámetros de ajuste para lactato 0 mM fueron A1 = 0,31, τ1 = 2,47 ns, A2 = 0,69, τ2 = 3,81 ns, σ gaussiano = 0,078 ns y χ2 = 1,09; y para lactato 100 mM fueron A1 = 0,56, τ1 = 0,93 ns, A2 = 0,44, τ2 = 2,3 ns, Gaussiano σ = 0,078 ns y χ2 = 1,11.

Ampliamos nuestra caracterización de LiLac a células de mamíferos, ya que las propiedades del biosensor pueden desviarse ligeramente entre las calibraciones in vitro e internas10,40,48. LiLac era brillante y estaba bien expresada en el citosol de las células de mamíferos. Las células HEK293T permeabilizadas que expresan LiLac mostraron valores de vida útil entre 3,0 y 1,8 ns en respuesta a cambios en el lactato perfundido que oscilan entre 0 y 100 mM, con una Kapp de 2,66 ± 0,18 mM medida a 34 ° C (Fig. 4d-e).

La gran respuesta y el alto brillo del biosensor LiLac generaron señales muy robustas en células de mamíferos, siendo superponibles las mediciones de vida útil de células individuales sometidas a cambios en el lactato (Fig. 5a-b). En comparación con la curva de calibración obtenida de células permeabilizadas, las células intactas mostraron una vida útil ligeramente mayor, lo que sugiere niveles más bajos de lactato dentro de las células en relación con la condición externa, y posiblemente reflejando diferencias en la entrada de lactato a través del transportador a medida que aumenta el [lactato] externo35,36,49 .

una tira de película con imágenes de toda la vida que muestran células HEK293T intactas que expresan LiLac a 34 ± 1 °C. Los valores de vida son muy uniformes en una población de células expuestas a una única concentración de lactato y responden a los cambios en la concentración de lactato en la solución del baño externo ([Lac]ex). Las células se incubaron en 0 lactato/0 glucosa antes de la obtención de imágenes. Barra de escala de 20 μm. b Los rastros de vida superpuestos de cada una de las 15 células observadas en (A) muestran que LiLac produce mediciones altamente reproducibles de las concentraciones de lactato intracelular en una población de células y es sensible incluso a manipulaciones modestas de lactato extracelular (1 a 2 mM). Mediciones registradas cada 15 s. c Tira de película y d rastros unicelulares de neuronas del hipocampo en un corte agudo que expresa LiLac. Se expusieron rodajas de glucosa 10 mM a lactato 0, 2 o 10 mM, después de lo cual se eliminaron tanto el lactato como la glucosa. Mediciones registradas cada 30 s. Barra de escala de 15 μm. Las imágenes están pseudocoloreadas por valores de vida empíricos de acuerdo con el mapa de calor, y los rastros indican vidas medias calculadas en una ventana de tiempo de llegada de 8 ns (τ8).

Comparamos el rendimiento de LiLac con el del biosensor de lactato compatible de por vida, Laconic. Si bien la producción de Laconic generalmente se interpreta como una relación FRET, la especie donante también produce un cambio mensurable en la vida útil, como es típico de los biosensores FRET. En las células, LiLac muestra un tamaño de respuesta ~6 veces mayor, una variabilidad reducida >5 veces y una relación señal-ruido sustancialmente mayor (LiLacSNR ~ 25, vida útil del donante Laconic, SNR <1; Supl. Fig. 6a-c). Aquí, la métrica SNR estima el cambio en la señal de vida útil en las células de 0 a 10 mM de lactato externo en relación con el nivel de ruido promedio en cada condición. También observamos que la vida útil de la especie donante lacónica varía ampliamente entre las células bañadas en lactato (Supl. Fig. 6b-c), como también se observa con su señal FRET23. En comparación, la alta precisión de la lectura de LiLac sugiere que la variabilidad entre células observada con Laconic puede ser un artefacto del biosensor. Si bien la fuente de esta variabilidad es indeterminada, la evidencia reciente sugiere que Laconic puede degradarse parcialmente en las células, produciendo alguna señal de fluorescencia que no está acoplada a la unión del lactato23.

Aprovechando el sólido desempeño de LiLac en células cultivadas, a continuación examinamos su desempeño en cortes agudos de cerebro de hipocampo (Fig. 5c-d). LiLac se expresó bien en las neuronas y respondió altamente a la aplicación en baño de diferentes concentraciones de lactato, exhibiendo una estrecha distribución de los valores de vida útil entre las neuronas, como se observó en su desempeño en células cultivadas. Los valores de vida útil en la condición final de lactato 0 mM/glucosa 0 mM fueron aproximadamente 0,1 ns más altos que en la condición inicial de lactato 0 mM/glucosa 10 mM, lo que demuestra que LiLac puede informar sobre perturbaciones en el [lactato] inicial en preparaciones ex vivo.

En conjunto, estos datos demuestran que LiLac es un sensor de vida útil de fluorescencia de alto rendimiento para lactato, y que los cambios en la vida útil de LiLac se pueden interpretar cuantitativamente. LiLac también es un biosensor de lactato de alto rendimiento cuando se utiliza sin medición de vida útil, simplemente monitoreando los cambios de intensidad. La exposición de células de mamíferos a 10 mM de lactato produce un cambio de intensidad considerable de >40% (Suplemento Fig. 7), que es comparable al del biosensor de lactato basado en intensidad más sensible23, pero con el beneficio adicional de una resistencia sustancial al pH. Por lo tanto, LiLac también se puede utilizar como biosensor intensiométrico, aunque se requeriría una normalización adicional para la determinación cuantitativa de los niveles de lactato.

Aquí hemos descrito una modalidad de detección, BeadScan, que aprovecha los microfluidos de gotas y las imágenes de fluorescencia automatizadas para analizar rápidamente grandes bibliotecas de biosensores fluorescentes codificados genéticamente y aislar biosensores optimizados en múltiples funciones. Utilizando BeadScan, diseñamos un sensor fluorescente de vida útil de alto rendimiento para lactato, llamado LiLac. La escala y la riqueza de las mediciones de fluorescencia permitidas por nuestro sistema aceleran el rendimiento de la detección en un orden de magnitud, lo que nos permitió analizar de manera más eficiente y exhaustiva el rendimiento del biosensor.

Para aislar biosensores de alto rendimiento, se deben probar grandes bibliotecas de biosensores en muchas condiciones diferentes. Las metodologías de detección existentes están limitadas en la cantidad de condiciones que se pueden analizar, lo que limita qué parámetros de rendimiento se pueden probar de manera factible. BeadScan supera estas limitaciones y también aumenta el rendimiento de detección. Los enfoques de detección de rendimiento comparable (por ejemplo, FACS y SortSeq)50,51,52 informan sobre un conjunto limitado de parámetros (por ejemplo, brillo del biosensor) probados bajo una única manipulación (por ejemplo, la presencia o ausencia de ligando) y no son compatibles con las mediciones de vida útil de la fluorescencia. . Incluso las pantallas sofisticadas y compatibles de por vida todavía tienen un número limitado de condiciones que pueden probarse13. Los microgeles semipermeables (GSB) utilizados en nuestro sistema de detección permiten el intercambio completo de condiciones, de modo que las variantes del biosensor encapsulado se pueden analizar frente a múltiples condiciones. Esto permite la recopilación de curvas dosis-respuesta completas en grandes bibliotecas, lo que proporciona información sobre la afinidad, especificidad y tamaño de la respuesta de unión al ligando.

Para adaptar los GSB para la detección de biosensores fluorescentes, fue necesario aumentar los niveles de expresión de proteínas en ~1000 veces. Lo logramos mediante el diseño de una tubería de microfluidos que comienza con la inmovilización de una biblioteca de ADN amplificada por PCR en perlas de afinidad, seguida de la expresión de variantes de biosensores individuales en gotitas de microfluidos, que finalmente se transforman en GSB. Nuestro enfoque de "PCR de perlas" mejora los métodos informados anteriormente, produciendo >200.000 copias clonales de >2 kb de ADNbc por perla de 6 μm. Los métodos existentes que inmovilizan los cebadores en una perla y luego los amplifican desde la superficie de la perla (por ejemplo, BEAMing) están limitados a ~1000 copias/cuenta para amplicones y perlas de tamaño comparable27,28. Suponemos que las restricciones de apiñamiento molecular en la superficie de las perlas limitan la eficiencia de la amplificación, mientras que nuestro método evita este problema al permitir que el ADN molde se amplifique en una solución libre en la gotita antes de la inmovilización en las perlas. Este avance, combinado con la optimización de las condiciones de reacción dentro de las gotitas, nos permitió alcanzar niveles de expresión micromolar de variantes de proteínas biosensoras únicas en gotitas IVTT y GSB posteriores.

Nuestro enfoque de detección multiparamétrica de alto rendimiento aceleró el desarrollo y la optimización de LiLac, un sensor de vida útil de alto rendimiento para lactato. La variante inicial de nuestro biosensor de lactato basado en TlpC mostró respuestas indeseables a los cambios en el pH fisiológico. Redujimos estas respuestas intercambiando el fluoróforo T-Sapphire por mTurquoise2, una proteína fluorescente cian resistente al pH que responde de por vida, y volvimos a seleccionar variantes que mostraban tanto respuestas grandes de lactato como respuestas mínimas de pH. Esta manipulación requirió la reoptimización del enlazador, lo cual requiere mucho trabajo usando otras metodologías de detección, pero es rutinario usando BeadScan. Desde una sola pantalla, pudimos aislar de más de mil variantes un solo biosensor que mostraba 1) sensibilidad reducida a [H+] (o pH), 2) rango dinámico mejorado y 3) afinidad por los niveles fisiológicos de lactato. A este biosensor altamente optimizado lo llamamos LiLac.

En células de mamíferos, la respuesta de por vida de LiLac supera a la de Laconic, el primer y más ampliamente utilizado biosensor de lactato codificado genéticamente, exhibiendo un tamaño de respuesta 6 veces mayor y una alta sensibilidad (SNR ~25). LiLac también se expresa bien y responde en células humanas y cortes cerebrales agudos, lo que demuestra que puede usarse para informar sobre las concentraciones de lactato intracelular en células cultivadas y preparaciones ex vivo. De hecho, la calibración de la respuesta de LiLac en células HEK293T permeabilizadas fue notablemente similar a la de los GSB producidos por IVTT, mostrando una mejora moderada en la excursión del sensor sin cambios significativos en Kapp. El dominio extracelular TlpC utilizado en el andamio LiLac tiene un segundo dominio de unión putativo (el dominio PAS distal) que puede reconocer un ligando aún no identificado y podría tener un efecto desconocido en la salida del sensor. Sin embargo, la similitud del desempeño de LiLac in vitro y en células sugiere que la respuesta de LiLac es de hecho altamente específica para el lactato en el contexto del entorno celular. Lo más importante es que LiLac está optimizado para mediciones cuantitativas, ya que la señal de vida útil no requiere calibración de pH ni normalización de artefactos de movimiento o niveles de expresión de proteínas.

Si bien la respuesta de vida de LiLac es altamente reproducible y fácil de cuantificar, su respuesta de intensidad también se puede utilizar para monitorear los niveles de lactato. Las mediciones de intensidad de fluorescencia son ampliamente accesibles y LiLac muestra un cambio de intensidad considerable comparable a otros sensores basados ​​en intensidad, pero con el beneficio adicional de una resistencia sustancial al pH. Como se demuestra aquí, la intensidad de LiLac (ΔF/F) se puede utilizar para rastrear los cambios de lactato intracelular en células individuales a lo largo del tiempo. La interpretación cuantitativa de la señal de intensidad requeriría ajustes adicionales para niveles de expresión variables y artefactos de movimiento, a menudo logrados mediante la normalización a un fluoróforo rojo inerte unido covalentemente, como mCherry. Sin embargo, la precisión de la normalización estaría sujeta a muchas advertencias bien documentadas asociadas con las imágenes de dos colores38,53.

El rápido aislamiento y el alto rendimiento de LiLac demuestran la ventaja de nuestro enfoque de detección, que mejora significativamente el rendimiento y el contenido de la detección del sensor y permite la coevaluación de múltiples parámetros del sensor (tamaño de respuesta, afinidad, especificidad/respuesta de pH, intensidad) para bibliotecas completas. . Aunque LiLac se analizó en un entorno in vitro, se tradujo notablemente bien en células. Creemos que el éxito de LiLac surge de cuán minuciosamente pudimos optimizar su respuesta de lactato, ajustando su afinidad para que coincida con el rango fisiológico y haciéndolo robusto frente a otros ligandos potenciales (en particular, H+) presentes en el medio celular. Los iones, incluido el H+, son ligandos importantes. De hecho, el receptor TlpB estructuralmente similar dirige los taxis de pH a través de un mecanismo de detección de pH en el dominio PAS distal de su dominio de unión extracelular33. Si bien las bibliotecas de TlpC no se analizaron frente a otras moléculas pequeñas, como piruvato u oxaloacetato, ya que estos parámetros se habían establecido previamente para el dominio de unión de TlpC31, BeadScan puede admitir pruebas de especificidad frente a ligandos covariados de moléculas pequeñas. Anticipamos que otros sensores solubles sujetos a parámetros de detección igualmente estrictos también se traducirían bien en células.

También prevemos que otros laboratorios podrán implementar el sistema BeadScan. Los costos de puesta en marcha de microfluidos están a la par con los del cribado de placas de 96 pocillos (cuatro de nuestras configuraciones de microfluidos se pueden construir por el costo de un lector de placas) y los dispositivos de microfluidos descritos aquí están disponibles comercialmente. El costo de un dispositivo generador de gotas de microfluidos es comparable al de una minipreparación y, debido a los requisitos de bajo volumen, los costos de los reactivos son insignificantes. Por supuesto, el equipo necesario para la obtención de imágenes de fluorescencia automatizadas es el que más contribuye a los costos iniciales. Aquí, hemos utilizado un microscopio 2p-FLIM automatizado para recopilar respuestas de vida útil de fluorescencia de las bibliotecas de sensores. Sin embargo, BeadScan podría adaptarse fácilmente para la detección basada en la intensidad de la fluorescencia en un microscopio de epifluorescencia equipado con una platina motorizada. En comparación con el cribado de placas de 96 pocillos, BeadScan permite un rendimiento significativamente mayor, ahorra tiempo y reduce aún más los costos de ejecución. Una muestra típica de GSB se puede preparar en dos días, lo que produce hasta cinco cubreobjetos para la detección, cada uno con hasta ~2000 variantes aisladas en GSB. Por tanto, resulta bastante práctico examinar decenas de miles de aislados cada semana. Si bien aislamos LiLac examinando solo un cubreobjetos, otras pantallas que buscan variantes muy raras podrían beneficiarse enormemente de este mayor nivel de rendimiento. Y aunque el rendimiento por sí solo es notable, el avance más notable surge de la capacidad de analizar múltiples condiciones frente a aislados únicos. Esta capacidad permite la cooptimización de características complejas del sensor, incluida la afinidad, el contraste y la especificidad/sensibilidad del pH, lo que distingue a BeadScan como metodología de detección.

BeadScan tiene algunas limitaciones. Actualmente no podemos evaluar la cinética de los biosensores dentro del entorno GSB, lo que requeriría una comprensión precisa de las tasas de difusión del ligando a través de la capa de polielectrolito. BeadScan también es más apropiado para detectar biosensores solubles, no biosensores asociados a membranas o basados ​​en GPCR54,55. Por el contrario, BeadScan tiene el potencial de detectar otros parámetros del biosensor que no se utilizan aquí, como la especificidad del ligando, la fotoestabilidad o el fotocromismo. Y si bien hemos demostrado que BeadScan produce respuestas de dosis precisas basadas en la vida útil de la fluorescencia, también se puede utilizar para medir las respuestas de intensidad de la fluorescencia con una corrección cuidadosa de los niveles de expresión de proteínas, artefactos de movimiento y efectos de fotoblanqueo.

Las mejoras futuras al sistema pueden abordar formas de capturar información cinética en sensores dentro del entorno GSB o la eficiencia de la generación de GSB. Debido a que los dos pasos de generación de gotas clasifican aleatoriamente las partículas (por ejemplo, piezas individuales de ADN o perlas de ADN individuales) en gotas, no todos los GSB codifican un sensor. La clasificación aleatoria es ineficiente, y otros sistemas que utilizan grandes perlas de hidrogel deformables para la administración de ADN pueden superar las estadísticas de Poisson, sincronizando las perlas para lograr una entrega casi perfecta en gotas (por ejemplo, ~100 % de las gotas contienen exactamente una perla de hidrogel)56,57 . Si bien las pequeñas perlas de poliestireno utilizadas en nuestro sistema no son deformables, es posible ajustar el sistema para permitir la entrega sincronizada de las perlas. Una modificación de este tipo podría mejorar significativamente la eficiencia y el rendimiento del cribado.

En conclusión, hemos presentado una pantalla para la optimización multiparamétrica altamente eficiente de biosensores fluorescentes y la hemos utilizado para generar un biosensor de lactato, LiLac, que puede usarse para la evaluación cuantitativa de concentraciones de lactato en células vivas. Anticipamos que este enfoque de detección será generalizable a otros biosensores solubles y que LiLac permitirá nuevos experimentos valiosos que investiguen el metabolismo del lactato.

Nuestro estudio cumple con todas las regulaciones éticas relevantes establecidas por el Comité de Seguridad Microbiológica de Harvard, la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Ley de Bienestar Animal y el Comité Permanente sobre Animales del Área Médica de Harvard (protocolo #IS00001113, garantía A3431- 01).

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyeron datos de los análisis. Los experimentos no fueron aleatorios. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.

Los dispositivos de microfluidos se adquirieron en Droplet Genomics (Vilnius, Lituania). Los esquemas de dispositivos de microfluidos personalizados se presentan en Suppl. Fig. 2. Los caudales de las fases de líquido y aceite (QX200TM Droplet Generation Oil para EvaGreen, BioRad) se controlaron utilizando bombas de jeringa personalizadas impresas en 3D operadas por un Arduino UNO conectado a dos motores paso a paso de dos ejes X-NUCLEO-IHM02A1. Placas de expansión de controladores de motor. Cada una de las fases se inyectó en dispositivos PDMS mediante microtubos de polietileno de grado médico (ID x OD: 0,015" x 0,043"/0,38 mm x 1,09 mm, Scientific Commodities Inc, BB31695-PE/2). Las imágenes se capturaron utilizando una cámara de alta velocidad (Pixelink, PL-D732MU-NIR-T) montada en el puerto ocular de un microscopio invertido Zeiss IM35.

Se tomaron imágenes de las gotas en un microscopio invertido Nikon TiE equipado con una unidad de disco giratorio Andor Revolution DSD usando un objetivo Plan Fluor 10X/0.3 NA o un objetivo Plan Apo VC 20X/0.75 NA (Nikon) iluminado con una fuente de luz LED (Spectra X; Lumencor, Beaverton, Oregón). La luz de excitación pasó a través de un filtro de paso de banda (578/16 nm para TexasRed, 482/18 nm para SYBR Green o 445/20 nm para biosensores basados ​​en T-Sapphire). La emisión roja se recogió a través de un filtro de paso de banda de 629/56 nm, después de un dicroico de paso corto de 590 nm. La emisión verde se recogió a través de un filtro de paso de banda de 525/39 nm, después de un filtro dicroico de paso corto de 490 nm. Las imágenes se analizaron utilizando ImageJ 1.53c.

Se recogieron imágenes de fluorescencia de vida útil de GSB y células de mamíferos utilizando un microscopio multifotónico Bergamo II equipado con digiFLIM (conteo de fotón único correlacionado en el tiempo digital) junto con un láser Tiberius de femtosegundo Ti: zafiro sintonizable (ambos de Thorlabs Inc., Newton, Nueva Jersey). ), con un objetivo de inmersión en agua Olympus UMPlanFL N 10x (NA 0,3). Los biosensores basados ​​en T-Sapphire se excitaron con luz de 790 nm y la luz de emisión se dividió con un espejo dicroico FF562-Di03 y se filtró paso de banda para canales de fluorescencia verde (FF01-525/50) y rojo (FF01-641/75). Los biosensores con mTurquoise2 se excitaron con luz de 850 nm y la luz de emisión se filtró con un filtro de paso de banda FF01-482/35 (todos los filtros ópticos de Semrock, Rochester, NY).

Las neuronas del hipocampo se visualizaron con un objetivo de inmersión en agua de 60 × (NA 1.0, Olympus LUMPLFLN) y LiLac se excitó a 850 nm usando un láser sintonizable de modo Ti-Sapphire Chameleon Vision-S (80 MHz, pulsos de ~75 fs, Coherent). , Santa Clara, California). La emisión de fluorescencia se dividió con un espejo dicroico FF562-Di03, se filtró de paso de banda (filtro FF01-482/35) y se detectó con un fotodetector híbrido R11322U-40 (Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japón). Las señales del fotodetector y las señales de sincronización del láser se preamplificaron y digitalizaron a 1,25 GHz utilizando una placa de matriz de puertas programable en campo (PC720 con módulos FMC125 y FMC122, 4DSP, Austin, TX).

Los histogramas de vida se ajustaron utilizando un ajuste de mínimos cuadrados no lineal en MATLAB (Mathworks, Natick, MA), con una caída de dos exponenciales convolucionada con una gaussiana para la función de respuesta al impulso47,58. Los valores de "vida útil empírica", utilizados para pseudocolorear los datos de la imagen, se calculan como el tiempo medio de llegada del fotón menos el valor ajustado para t0. Para experimentos en células cultivadas y preparaciones ex vivo, los valores de vida útil se informan como un valor estandarizado "τ8", donde la restricción del promedio a la ventana de tiempo aproximada de los datos reales (0–8 ns) minimiza las diferencias entre las configuraciones experimentales10.

Los GSB se pueden preparar con proteína biosensora purificada. Para este tipo de preparación, primero se eliminó el NADH de la proteína biosensora Peredox purificada mediante diálisis con NAD+ 1 mM, piruvato 10 mM, LDH 5 U/ml (Worthington Biochemical Corp., Lakewood, Nueva Jersey) en MOPS 50 mM, pH 7,3, 90. KCl mM, NaCl 10 mM. Luego se añadió a una mezcla de gel de agarosa al 1% (en sol; Tipo IX-A, Sigma) y alginato al 1% (Pronova UP LVG, Dupont) y se emulsionó a 30 °C usando un generador de gotas. Se dispersaron 5 µl de gotitas de gel en 500 µl de una emulsión de PAH polidispersa (10 mg/ml de PAH, Alfa Aesar 43092, PM ~120.000 en NaCl 500 mM, se agitó en HFE7500 + 0,15 % de tensioactivo fluorado RAN007) y la emulsión mixta se rompió con 30 % de PFO (1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-octanol; VWR, B20156-18) para permitir la complejación del polímero y la formación de capas. Los GSB resultantes contienen sólo la proteína biosensora purificada.

Los GSB se depositaron en cubreobjetos de vidrio y se tomaron imágenes en 2p-FLIM mientras se perfundían las condiciones preparadas en Tris 50 mM, KCl 90 mM, NaCl 10 mM, con el pH y la concentración de ligando indicados. Las condiciones de Peredox se prepararon como se describió anteriormente47. Brevemente, se utilizaron diferentes proporciones de lactato/piruvato para producir diferentes proporciones de NAD+/NADH añadiendo LDH purificada, un método altamente reproducible utilizado como ajuste de las impurezas de los reactivos. Las soluciones experimentales contenían NAD total 1 mM (formas NADH y NAD+) y lactato y piruvato total 10 mM. Los datos de dosis-respuesta se analizaron utilizando GraphPad Prism 7.0247.

Las bibliotecas TlpC-TS y -TQ tomaron muestras de 49.152 variantes únicas de biosensores con diferentes composiciones, longitudes y puntos de inserción de enlazadores. Las bibliotecas se generaron utilizando oligonucleótidos degenerados que contienen variación de codones dentro de las regiones enlazadoras, flanqueadas por una secuencia de hibridación y una secuencia saliente de Gibson (Genewiz). Oligos degenerados (TlpCTS_LL01_F: CATAAGCTTGAGTACAACTYCWMCGSCSRCRYCGGCATTGACCCCTTTACTGAA, TlpCTS_LL01_R: GTTTGTCAGCCATGATATAAACGTTGYDGKSGYKGRAAAAGACTAAAGATTTATTG; TlpCTQ_LL01_F: CTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTYCWMCGSCSRCRYCGGCATTGACC CCTTTACTGAA, TlpCTQ_LL01_R: CTTGTCGGGCGGTGATATAGACGTTGYDGKSGYKGRAAAAGACTAAAGATTTATTG) se utilizaron como cebadores en una reacción de PCR estándar (Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix, NEB) para amplificar T-Sapphire- o mTurquoise2-. que contiene plantilla (pRsetB-Peredox o Lck-cpmTq2-Calcium-lifetime-sensor, respectivamente).

Para preparar la columna vertebral del vector, primero generamos un plásmido de estadificación que consiste en una columna vertebral pRsetB, una proteína fluorescente T-Sapphire o mTurquoise2 con codones optimizados de E. coli y un gen TlpC con codones optimizados de E. coli (sintetizado como gBlock, IDT). insertado en la posición 144 dentro de la proteína fluorescente. El plásmido de estadificación se digirió con HindIII y AclI para la biblioteca TlpC-TS o se amplificó por PCR para la biblioteca TlpC-TQ (BB_TQ_F: GTCTATATCACCGCCGAC, BB_TQ_R: GTTGTACTCCAGCTTGTG).

Las bibliotecas de plásmidos se generaron mediante el ensamblaje Gibson de 2 fragmentos del inserto de la biblioteca y la columna vertebral del vector (NEBuilder HiFi DNA Assembly, New England Biolabs). Para eliminar los productos de reacción incompletos, el producto de Gibson se “pulió” mediante PCR usando cebadores específicos de vector (pRSET_F: cgcgttggccgattcatt, pRSET_R: gaagcatttatcagggttattgtctcatg), produciendo una biblioteca de ADN lineal que contiene elementos críticos para la transcripción y traducción (promotor T7, RBS y T7). terminador).

El ADN molde de copia única se aisló y amplificó en gotitas de microfluidos mediante la realización de PCR en emulsión. Se mezcló ADN molde "pulido" diluido (0,1 pg/μl de molde de 2 kb) con reactivos de PCR y se emulsionó a una velocidad de 107 gotas/hora usando un generador de gotas de microfluidos diseñado para producir gotas de 35 μm (Droplet Genomics, DG-DM- 35). La reacción también incluyó reactivos de PCR de inicio en caliente (Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix, NEB), cebador 5'-DualBiotin-Reverse 0,05 μM (5'-DualBiotin-iSp18-TGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATG, IDT; iSp18 es un 18- interno espaciador de hexaetilenglicol atómico) y cebador 5'-TexasRed-Forward 0,5 μM (5'-TexasRed-CGCGTTGGCCGATTCATT, Genewiz). El cebador DualBiotin-Reverse permite la inmovilización aguas abajo en perlas de estreptavidina y hibrida ~300 pb aguas abajo del terminador T7 para distanciar el marco de lectura abierto de la superficie de las microperlas. El fluoróforo TexasRed permite confirmar la carga de ADN en microperlas. La emulsión de gotas de 600 µL se dividió en tubos de PCR (50 µL/tubo), se cubrió con aceite mineral y se termocicló (programa de PCR: 98 °C, 30 s; [98 °C, 10 s; 60 °C, 16 s; 72 °C, 1 min 30 s] x 30; 72 °C, 2 min; 4 °C, mantener) sin tapa calentada. Después de la amplificación por PCR, se reunió la emulsión, se hizo girar suavemente en una picofuga y se recuperó la emulsión fina de debajo de la emulsión gruesa.

Para confirmar la amplificación, se tiñó una muestra de diagnóstico de la emulsión con SYBR Green (Sigma-Aldrich) y se tomaron imágenes. Según la distribución de Poisson y un promedio de 1 copia de la plantilla por gota, se esperaría que el 37% de las gotas no tuvieran amplificación (0 copias de la plantilla) y el 63% tuvieran amplificación como lo muestra la fluorescencia verde SYBR (≥1 copia). de plantilla).

Para mantener la clonalidad, se introdujeron microfluídicamente perlas de estreptavidina en gotitas de PCR individuales mediante la fusión activa controlada de gotitas59, luego se recuperaron de las gotitas, se lavaron y se concentraron.

Para minimizar la agregación de proteínas durante la reacción IVTT posterior, cada perla de estreptavidina se limitó a aproximadamente 100 000 copias de ADN mediante el bloqueo previo de un subconjunto de sitios de unión de estreptavidina con biotina. Se incubaron 750 µl de perlas de estreptavidina (partículas de poliestireno recubiertas con NeutrAvidin de 6 a 8 µm de diámetro a 3,4 x 104 perlas/ µl; Spherotech, NVP-60-5) con 3 µl de 1 µM de cebador 5'-DualBiotin-Reverse durante 5 minutos. y luego se lavó tres veces con Binding Buffer (NaCl 1 M, EDTA 0,5 mM) usando Pierce™ Spin Cups. Finalmente, las perlas se resuspendieron en 400 µl de tampón de unión 1,5X (NaCl 1,5 M, EDTA 0,75 mM). La alta concentración de sal se adaptó en densidad a las partículas de poliestireno para evitar la sedimentación de las perlas.

Las gotitas de PCR se reinyectaron en un dispositivo de fusión de gotitas personalizado (Droplet Genomics) y se sincronizaron mediante un flujo dependiente del tamaño con gotitas de perlas de estreptavidina generadas en el chip. Se electrofusionaron gotas pareadas a una velocidad de 106 gotas/hora (Suplemento Fig. 2) cuando pasan por un electrodo que suministra un pulso de alto voltaje y alta frecuencia (salida de 10 kHz, 0,5 kV). El voltaje se aplicó utilizando un generador de pulsos Digilent Discovery 2 conectado a un amplificador de alto voltaje Trek Modelo 2220, y la conexión eléctrica se realizó con cables de alto voltaje (Pasternack, PE3C3334-200CM).

La emulsión fusionada se recogió del chip en un tubo Eppendorf y posteriormente se rompió con PFO al 35 % (1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-octanol; VWR, B20156-18) en presencia de NaCl 1 M, 0,5 mM. EDTA, biotina 1 mM. Las perlas se lavaron tres veces con NaCl 1 M, EDTA 0,5 mM usando PierceTM Spin Cups (VWR 69702) y se resuspendieron hasta una densidad final de ~200.000 perlas/μL en Tris 5 mM, pH 7,3, KCl 9 mM, NaCl 1 mM para uso inmediato con IVTT, o en TE para almacenamiento a largo plazo a 4 °C (con una capa de aceite mineral para evitar la evaporación). Para confirmar la carga de ADN en las perlas, se evaluó la fluorescencia TexasRed de una muestra de diagnóstico mediante imágenes de epifluorescencia.

Para expresar proteínas biosensoras en gotitas, se encapsularon perlas de ADN en gotitas que contenían reactivos IVTT purificados (PUREfrex2.0, GeneFrontier) suplementados con chaperonas (DnaK mix, GeneFrontier).

Para evitar la transcripción prematura, las perlas de ADN se administraron mediante microfluidos en los reactivos IVTT inmediatamente antes de la encapsulación de las gotitas utilizando un dispositivo generador de gotitas de coflujo de dos corrientes personalizado (Droplet Genomics). Los caudales se controlaron de modo que la suspensión de perlas se combinara en una proporción de 1:4 con los reactivos IVTT para minimizar la dilución de la reacción. Para un volumen de reacción total de 40 µL, se inyectaron 8 µL de perlas de ADN y 32 µL de reactivos IVTT (20 µL de Solución I, 2 µL de Solución II, 2 µL de Solución III, 2 µL de mezcla DnaK, 6 µL de agua libre de RNasa). en el generador de gotas de coflujo a una velocidad de 25 μL/h y 100 μL/h, respectivamente. Se inyectó aceite de generación de gotas a 800 μl/h para lograr un tamaño de gota de 30 μm. Se recogieron gotitas de IVTT fuera del chip y se expresó la proteína del biosensor durante la noche a 30 °C.

Las gotitas de IVTT se transformaron en GSB mediante una serie de pasos de manipulación de gotitas. Primero, se administraron agarosa (agarosa tipo IX-A, Sigma) y alginato (alginatos Pronova UP LVG y Pronova UP VLVG, Dupont) en las gotitas de IVTT mediante electrocoalescencia. Para evitar la gelificación prematura de la agarosa, la manipulación del gel y la fusión de las gotas se realizaron en una sala con temperatura controlada a 30 o 37 °C.

Se prepararon reservas de agarosa al 5 % (en sol), alginato de VLVG al 5 % y alginato de LVG al 3 % en HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 90 mM, NaCl 10 mM y se combinaron con nanoesferas de Ni-NTA (Kisker-biotech, PPS -0,2NI-NTA) y glicerol estéril al 50% hasta concentraciones finales de 1,5% de agarosa, 1,5% de alginato de LVG, 0,4% de alginato de VLVG, 5% de glicerol y nanoesferas de Ni-NTA de 2,5 mg/ml en 200 l. Las nanoesferas de Ni-NTA ayudan a retener las proteínas biosensoras marcadas con His durante la deposición posterior del polímero, mientras que se añadió glicerol para igualar la osmolaridad de las gotitas de IVTT. La mezcla de gel/polímero y las gotitas de IVTT se inyectaron en un dispositivo de fusión de gotitas a 25 µL/h y 20 µL/h, respectivamente, con 165 µL/h de aceite de generación de gotitas y 50 µL/h de aceite espaciador. Se fusionaron IVTT emparejados y gotitas de gel/polímero utilizando los mismos parámetros de pulso que para la PCR y las gotitas de perlas. La emulsión fusionada se recogió del chip y luego se puso en hielo durante 10 a 20 minutos para gelificar la agarosa.

Para recubrir las gotitas de gel con la cubierta de polielectrolito, se suspendieron 5 µl de gotitas en 500 µl de emulsión de PAH polidispersa y ambas emulsiones se rompieron con PFO al 30 %. Los GSB resultantes se sedimentaron con centrifugación suave y se lavaron tres veces con Tris 50 mM, pH 7,5, KCl 90 mM, NaCl 10 mM. Los GSB concentrados se depositaron sobre cubreobjetos flameados con etanol, grabados con ácido nítrico (cobertor cuadrado, #1.5, 10 × 10 mm, Ted Pella), tratados con EDTA 50 mM durante 20 minutos para liberar la proteína biosensora marcada con His del Ni-NTA. nanoesferas e inmediatamente examinadas en busca de respuestas de biosensores.

Se colocaron cubreobjetos recubiertos con GSB que expresaban una biblioteca de biosensores en una cámara de perfusión y se tomaron imágenes a temperatura ambiente con 2p-FLIM. Las condiciones se prepararon en Hepes 50 mM, pH 7,5, KCl 90 mM, NaCl 10 mM y se intercambiaron diferentes condiciones entre conjuntos de imágenes, muestreando un total de 6 a 10 condiciones durante un experimento. Las imágenes de fluorescencia durante toda la vida se recopilaron utilizando el software ThorImageLS (v4.2.2020.3061) y se analizaron utilizando un software creado en laboratorio escrito en MATLAB. Se recogieron imágenes de vida útil de fluorescencia en mosaico para el cubreobjetos completo; la primera serie se analizó para encontrar todas las ROI circulares dentro de un rango de brillo seleccionado (usando la función estándar imfindcircles.m); y se analizó la serie de imágenes completa para obtener curvas de dosis-respuesta para cada ROI individual. Para todas las respuestas a las dosis, se administraron soluciones con diferentes concentraciones de lactato en orden aleatorio para minimizar los artefactos de fotoblanqueo.

Después de seleccionar e identificar a los ganadores, se utilizó un capilar de pared delgada para recuperar los GSB objetivo. Los capilares de recuperación se extrajeron de tubos capilares de vidrio de borosilicato en un extractor de filamentos calentado horizontal (P-97; Sutter Instrument) hasta un diámetro de punta de 15 a 30 μm, se manipularon utilizando un Burleigh PCS-6000 (Thorlabs) y se conectaron a una jeringa. a través de tubos de plástico para permitir el control manual de la succión. Antes de sumergir el capilar en la solución del baño, el capilar se rellenó con 2 a 5 uL de NaOH 0,1 M. La punta se colocó junto al GSB objetivo y la solución de NaOH 0,1 M se dispensó lentamente para disolver suavemente la cubierta de polielectrolito. Luego, el gel expuesto y la perla de ADN se colocaron en la punta del capilar, se retiraron del baño y se colocaron en un tubo de PCR que contenía 4 µl de Tris 10 mM, pH 7,3.

Se agregaron reactivos de PCR al tubo (Q5 Hot Start Master Mix, NEB) con cebadores directos e inversos específicos del inserto 0,5 μM y se termociclaron (98 °C, 30 s; [98 °C, 10 s; 50 °C o 64 s). °C, 16 s; 72 °C, 30 s] x30; 72 °C, 2 min; 4 °C, mantener). Para los GSB de TlpC-TS, los cebadores de recuperación (TlpC_TS_Recovery_F: TTACTACCTTCTCCTATG, TlpC_TS_Recovery_R: TACCGTTCTTCTGTTT) se hibridaron a 50 °C para producir un amplicón de 1104 pb. Para los GSB de TlpC-TQ, los cebadores de recuperación (TlpC_TQ_Recovery_F: CATCGAGCTGAAGGGCATC, TlpC_TQ_Recovery_R: GTCCTCGATGTTGTGGC) se hibridaron a 64 °C para producir un amplicón de 964 pb. Sanger secuenció inmediatamente una parte del ADN purificado en gel para recuperar la identidad de las regiones enlazadoras, mientras que el resto del amplicón se reintegró en un vector para su validación y clonación posteriores.

El ADN principal se preparó mediante PCR amplificando el plásmido de estadificación correspondiente (cebadores TlpC-TS: GATAGCGGGCGAAAAC, AACGTTTATATCATGGCTGAC; cebadores TlpC-TQ: GCCACAACATCGAGGAC, GATGCCCTTCAGCTCGATG). El ADN de la columna vertebral se purificó en gel y se combinó con el ADN del inserto utilizando un ensamblaje Gibson (NEBuilder HiFi DNA Assembly, New England Biolabs). Se transformaron células NEB5alfa (NEB) con el producto de Gibson y se cultivaron, miniprepararon y secuenciaron colonias individuales. También se subclonaron biosensores en vectores de expresión bacterianos para que la proteína del biosensor pudiera purificarse y someterse a pruebas de especificidad in vitro.

Para preparar una muestra uniforme de LiLac GSB, se cargaron en masa perlas de estreptavidina prebloqueadas con ADN de LiLac purificado que se amplificó por PCR a partir de un único plásmido con cebadores 5'-TexasRed-Forward y 5'-DualBiotin-Reverse. Se utilizaron perlas de ADN uniformes para generar una muestra uniforme de GSB, siguiendo el mismo protocolo que para las bibliotecas de biosensores.

Los datos de dosis-respuesta se analizaron utilizando GraphPad Prism 7.02. Los datos se representaron como vida útil de la fluorescencia (ns) frente a [lactato] (mM) y se ajustaron con una ecuación de Hill con la forma de la ecuación. 1:

donde LTmin y LTmax son las asíntotas de vida útil inferior y superior, respectivamente, K0.5 es el punto medio de la curva y nH es el coeficiente de Hill, que se fijó en −1.

Para los experimentos realizados a 34 °C, la temperatura del baño se controló utilizando un calentador de solución en línea (64-0103, Warner Instruments, Hamden, CT) conectado a un controlador de temperatura TC-324B (Warner Instruments). La lectura del termistor se supervisó mediante el software ThorSync (v4.0.2019.6171) y se verificó y corrigió mediante un biosensor de termopar conectado a un termómetro BAT-12 (Sensortek, Clifton, Nueva Jersey).

Escherichia coli BL21 DE3 (NEB) se transformó con pRsetB-LiLac. Se usó una sola colonia para inocular 2 cultivos de 1 litro en Terrific Broth, durante la noche a 37 °C, 200 rpm. Los cultivos se enfriaron en hielo, se suplementaron con IPTG 0,1 mM y se indujeron a 18 °C, 200 rpm durante 36 h. Los pellets se centrifugaron, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Los sedimentos celulares congelados se resuspendieron en tampón de lisis helado (NaH2PO4 50 mM, imidazol 10 mM, pH 8), suplementado con 1 pastilla de cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA (Roche) por 25 ml de tampón, PMSF 1 mM, 0,1 mg/ml de lisozima y 1 µl de Pierce Universal Nuclease (Thermo Fisher) por 25 ml de tampón. La resuspensión se sonicó en hielo al 30% de potencia, en pulsos de 10 s encendido/20 s apagado, para un total de 2 min de sonicación; el lisado se nutró durante 30 min a 4 °C. El lisado se centrifugó durante 20 min a 4 °C, 48.380 x g. El sobrenadante se hizo fluir sobre Ni-NTA preequilibrado en tampón de lisis, se lavó con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de lisis y luego se lavó con 10 CV de tampón de lavado (NaH2PO4 50 mM, imidazol 25 mM, pH 8). La proteína se eluyó en un tampón que contenía NaH2PO4 50 mM, imidazol 500 mM, pH 8. La proteína eluida concentrada se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño, usando una columna TSK G3000SWxL (GE Healthcare) equilibrada en un tampón continuo que consistía en NaHepes 50 mM. , NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM, CHAPS al 0,1%, DTT 1 mM, pH 7,4. Las fracciones que contenían proteínas se combinaron, se concentraron usando un concentrador giratorio MWCO de 30 kDa (Amicon), se intercambiaron en un tampón que contenía MOPS 25 mM, KCl 90 mM, NaCl 10 mM, suplementado con glicerol al 5%, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y almacenado a -80 ° C.

Los espectros de excitación y emisión de fluorescencia se adquirieron utilizando un lector de microplacas multimodo SpectraMax iD5 (Molecular Devices). LiLac se diluyó a ~500 nM en tampón MOPS a temperatura ambiente con lactato 0 o 100 mM, y los espectros se adquirieron por cuadruplicado y luego se promediaron. Los espectros de excitación se midieron en incrementos de 2 nm desde 350 a 460 nm, midiendo la emisión a 500 nm. Los espectros de emisión se midieron en incrementos de 2 nm desde 465 a 649 nm utilizando excitación a 425 nm.

Para determinar el rendimiento cuántico relativo de LiLac, se realizaron mediciones de fluorescencia utilizando un espectrofluorómetro PTI QuantaMaster-8000 controlado por el software PTI Felix 32 (Photon Technology International). La proteína se diluyó a 0,0025 < A440 < 0,025 en tampón MOPS a temperatura ambiente con o sin lactato, por triplicado; Como estándar se utilizó naranja de acridina en etanol con KOH 0,01 M60. Los espectros de emisión de fluorescencia se registraron entre 450 y 650 nm (rendija de 2,5 nm), utilizando una excitación de 440 nm. Los espectros se integraron y analizaron en GraphPad Prism.

Para determinar el coeficiente de extinción de LiLac, las absorbancias se midieron utilizando un espectrofotómetro UV-Vis BioMate 160 (ThermoFisher Scientific), usando un rango de 290 a 650 nm, con un tamaño de paso de 2 nm y usando un tampón como referencia. Las concentraciones de proteínas se midieron utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules). Los coeficientes de extinción en los estados libre de lactato y unido a lactato se determinaron utilizando la Ley de Beer-Lambert, por triplicado técnico.

La calibración interna de LiLac se realizó como se describió anteriormente10. Brevemente, se tomaron imágenes de células HEK293T permeabilizadas (obtenidas de ATCC) que expresaban el biosensor LiLac en presencia de diferentes concentraciones de lactato administrado en la siguiente solución base (en mM): 140 K-gluconato, 10 NaCl, 10 HEPES, 1 EGTA, 1,324 MgCl2, 0,346 CaCl2 y pH 7,35 a 34 °C. Las células se transfirieron a la cámara de imágenes y, después de aproximadamente 10 minutos en la solución, se permeabilizaron con β-escina 45 μM durante aproximadamente 2 minutos y luego se tomaron imágenes en la solución sin el agente permeabilizante. Todas las soluciones contenían 2 μM del inhibidor de lactato deshidrogenasa, GSK-2837808A (Tocris Bioscience, Cat#5189; CAS:1445879-21-9).

Las células HEK293T se cultivaron en un ambiente de CO2 al 5% a 37 °C en DMEM suplementado con Glutamax, suero bovino fetal al 10% y penicilina/estreptomicina. Para los experimentos de transfección, se sembraron aproximadamente 150.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos que contenían cubreobjetos de vidrio limpios recubiertos de protamina. Después de alcanzar ~50% de confluencia, las células se transfectaron con ~500 ng/pocillo de pAAV-CAG-LiLac, utilizando el método de polietilenimina. Se tomaron imágenes de las células entre 16 y 48 h después de la transfección. Las células se transfirieron a glucosa-Hepes-ACSF 0 precalentado (Hepes 10 mM, NaH2PO4 1 mM, NaCl 146 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,4) 20 minutos antes de la obtención de imágenes 2p-FLIM en 34 ºC.

La relación señal/ruido (SNR) se calcula como señal/ruido. La señal se estimó tomando los valores medios de vida en las células con lactato externo de 0 y 10 mM, y luego tomando la diferencia absoluta entre las dos condiciones. El ruido se estimó calculando la desviación estándar de los valores para cada condición y luego promediando. Datos mostrados en Supl. Figura 6.

En este estudio se utilizaron ratones C57BL/6 N machos y hembras de tipo salvaje de entre 14 y 24 días de edad. Los animales se criaron internamente en jaulas ventiladas dentro de una instalación de barrera, que mantenía un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, temperatura regulada de la jaula (24 °C) y humedad (53%) y proporcionaba acceso ad libitum al agua y a los alimentos (Picolab Rodent Diet 5053). Todos los experimentos se realizaron de conformidad con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y la Ley de bienestar animal. Los protocolos específicos fueron aprobados por el Comité Permanente sobre Animales del Área Médica de Harvard.

Se utilizaron vectores adenoasociados (AAV; obtenidos de Viral Core Facility en el Boston Children's Hospital o del núcleo viral de NYUAD) hechos a medida para la expresión de biosensores en cortes cerebrales agudos. Para la expresión de Laconic utilizamos el serotipo AAV2/9 y el promotor CAG. Para la expresión de LiLac utilizamos el serotipo PhP.eB y el promotor CAG.

La expresión lacónica o LiLac en el hipocampo se logró mediante inyección estereotáxica intracraneal de crías de ratón P1-P2 utilizando métodos publicados61. Después de la crioanestesia, a los cachorros se les inyectaron 150 nl de AAV, dos veces por hemisferio, en las siguientes coordenadas con respecto a lambda: (i) 0 mm en la dirección anteroposterior, ±1,9 mm en el eje medial-lateral y −2,0 mm en dirección dorsal-ventral; y (ii) 0 mm en la dirección anteroposterior, ±2,0 mm en el eje medial-lateral y −2,3 mm en la dirección dorsal-ventral.

Se anestesiaron ratones de entre 14 y 24 días de edad con isoflurano, se decapitaron y se extrajo el cerebro en una solución de corte enfriada con hielo que contenía (en mM) 87 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 75 sacarosa, 25 D-glucosa, 0,5 CaCl2 y 7 MgCl2 (~335 mOsm/kg) y se burbujearon con 95 % de O2 y 5 % de CO2. El cerebro se pegó por el lado dorsal, se incrustó en agarosa al 2% en solución salina tamponada con fosfato y se sumergió en una cámara con una solución de corte helada. Se cortaron rodajas horizontales de 275 μm utilizando un Compresstome (VF-310-0Z, Precisionary, Natick, MA) y se transfirieron inmediatamente a una cámara con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenía (en mM) 120 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 D-glucosa, 2 CaCl2 y 1 MgCl2 (~290 mOsm/kg) que se calentó a 36 °C y se burbujeó con 95 % de O2 y 5 % de CO2. Después de 35 minutos, la cámara se movió a temperatura ambiente y las rebanadas allí se usaron durante las siguientes 4 h. Las rodajas se adhirieron a cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina, se colocaron en una cámara de baño montada en un microscopio 2p-FLIM y se perfundieron con ACSF burbujeado con 95 % de O2 y 5 % de CO2. El lactato de sodio se disolvió directamente en soluciones de ACSF. El ACSF sin glucosa se preparó omitiendo D-glucosa de la solución. La temperatura se controló utilizando un calentador de solución en línea (64-0103, Warner Instruments, Hamden, CT) conectado a un controlador de temperatura TC-344C (Warner Instruments). El control del microscopio y la adquisición de imágenes se realizaron mediante una versión modificada del software ScanImage escrito en MATLAB62.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos de origen numéricos para todas las figuras se proporcionan en el archivo de datos de origen; Las secuencias de ADN y proteínas para el sensor LiLac se proporcionan en la Nota complementaria 1.

Los plásmidos que codifican LiLac se han depositado y se distribuyen a través de addgene.org (pRsetB-KanR-LiLac como Addgene #184569 y pAAV-CAG-LiLac como Addgene #184570); Los mapas y secuencias de plásmidos se pueden descargar desde el sitio web addgene.org.

El código para analizar imágenes de cuentas está disponible públicamente en https://github.com/gyellen/BeadScan.

Díaz-García, CM et al. La estimulación neuronal desencadena la glucólisis neuronal y no la absorción de lactato. Metabolismo celular. 26, 361–374.e4 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Zhang, Y. et al. Indicadores de calcio GCaMP rápidos y sensibles para obtener imágenes de poblaciones neuronales. http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/2021.11.08.467793 (2021) https://doi.org/10.1101/2021.11.08.467793.

Nasu, Y., Shen, Y., Kramer, L. y Campbell, RE Diseño guiado por estructura y mecanismo de biosensores basados ​​en proteínas fluorescentes individuales. Nat. Química. Biol. 17, 509–518 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sabatini, BL & Tian, ​​L. Imágenes de la dinámica de neurotransmisores y neuromoduladores in vivo con indicadores codificados genéticamente. Neurona 108, 17–32 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Greenwald, EC, Mehta, S. y Zhang, J. Los biosensores fluorescentes codificados genéticamente iluminan la regulación espaciotemporal de las redes de señalización. Química. Rev. 118, 11707–11794 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Díaz-García, CM et al. Las distintas funciones del calcio en el control rápido de la glucólisis neuronal y el ciclo del ácido tricarboxílico. Elife 10, e64821 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

van der Linden, FH et al. Un biosensor de fluorescencia turquesa de por vida para obtener imágenes cuantitativas de calcio intracelular. Nat. Comunitario. 12, 7159 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lau, AN et al. Disección del metabolismo específico del tipo de célula en el adenocarcinoma ductal de páncreas. Elife 9, e56782 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carpenter, L. & Halestrap, AP La cinética, la especificidad del sustrato y del inhibidor del transportador de lactato de las células tumorales de Ehrlich-Lettre se estudiaron con el indicador de pH intracelular BCECF. Biochem J. 304 (parte 3), 751–760 (1994).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Díaz-García, CM et al. Imágenes cuantitativas in vivo de concentraciones neuronales de glucosa con un sensor de vida útil de fluorescencia codificado genéticamente. J. Neurosci. Res. 97, 946–960 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Molina, RS et al. Instrumento de alto rendimiento para detectar proteínas fluorescentes bajo excitación de dos fotones. Biomédica. Optar. Expreso 11, 7192–7203 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Dana, H. y col. Sensores de calcio de alto rendimiento para obtener imágenes de la actividad en poblaciones neuronales y microcompartimentos. Nat. Métodos 16, 649–657 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Maná, P. et al. Evolución dirigida de la vida útil y el brillo del estado excitado en FusionRed utilizando un clasificador de microfluidos. Integral Biol. 10, 516–526 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Goedhart, J. y col. Evolución guiada por la estructura de proteínas fluorescentes cian hacia un rendimiento cuántico del 93%. Nat. Comunitario. 3, 751 (2012).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Hung, YP, Albeck, JG, Tantama, M. y Yellen, G. Imágenes del estado redox NADH-NAD(+) citosólico con un biosensor fluorescente codificado genéticamente. Metabolismo celular. 14, 545–554 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tantama, M., Hung, YP y Yellen, G. Imágenes del pH intracelular en células vivas con un sensor de proteína fluorescente roja codificado genéticamente. Mermelada. Química. Soc. 133, 10034–10037 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fischlechner, M. y col. Evolución de catalizadores enzimáticos enjaulados en perlas de gel biomiméticas. Nat. Química. 6, 791–796 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hui, S. y col. La glucosa alimenta el ciclo del TCA a través del lactato circulante. Naturaleza 551, 115-118 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Rabinowitz, JD & Enerbäck, S. Lactato: el patito feo del metabolismo energético. Nat. Metab. 2, 566–571 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Faubert, B. y col. Metabolismo del lactato en tumores de pulmón humanos. Celda 171, 358–371.e9 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

San Martín, A. et al. Un sensor de lactato FRET codificado genéticamente y su uso para detectar el efecto Warburg en células cancerosas individuales. PLoS One 8, e57712 (2013).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Barros, LF et al. Lo pequeño es rápido: metabolismo astrocítico de glucosa y lactato a resolución celular. Neurociencias de células frontales. 7, 27 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bekdash, R. y col. GEM-IL: Un indicador de lactato fluorescente de alta respuesta. Métodos de representante celular 1, 100092 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Harada, K. y col. Indicadores de lactato y piruvato a base de proteínas fluorescentes verdes adecuados para ensayos bioquímicos e imágenes de células vivas. Ciencia. Rep. 10, 19562 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Galaz, A. et al. Imágenes de la relación lactato/piruvato utilizando un indicador de transferencia de energía por resonancia de Förster genéticamente codificado. Anal. Química. 92, 10643–10650 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nasu, Y. et al. Un biosensor fluorescente codificado genéticamente para L-lactato extracelular. Nat. Comunitario. 12, 7058 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Diamante, L., Gatti-Lafranconi, P., Schaerli, Y. & Hollfelder, F. Detección de afinidad in vitro de aglutinantes de proteínas y péptidos mediante visualización de superficie de perlas megavalentes. Ing. Proteínas. Des. Sel. 26, 713–724 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, KW y Vogelstein, B. Transformación de moléculas individuales de ADN en partículas magnéticas fluorescentes para la detección y enumeración de variaciones genéticas. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 100, 8817–8822 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mächler, P. et al. Evidencia in vivo de un gradiente de lactato de astrocitos a neuronas. Metabolismo celular. 23, 94-102 (2016).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Zuend, M. et al. La actividad cortical inducida por la excitación desencadena la liberación de lactato por parte de los astrocitos. Nat. Metab. 2, 179-191 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Machuca, MA et al. El quimiorreceptor TlpC de Helicobacter pylori media la quimiotaxis al lactato. Ciencia. Rep. 7, 14089 (2017).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hazelbauer, GL, Falke, JJ & Parkinson, JS Quimiorreceptores bacterianos: señalización de alto rendimiento en matrices en red. Tendencias Bioquímica Ciencia. 33, 9-19 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Sweeney, EG, Perkins, A., Kallio, K., James Remington, S. y Guillemin, K. Estructuras del dominio de unión al ligando del quimiorreceptor TlpA de Helicobacter pylori. Ciencia de las proteínas. 27, 1961-1968 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cori, CF & Cori, GT Formación de glucógeno en el hígado a partir del ácido d- y l-láctico. J. Biol. Química. 81, 389–403 (1929).

Artículo CAS Google Scholar

Halestrap, AP y Meredith, D. La familia de genes SLC16: desde transportadores de monocarboxilatos (MCT) hasta transportadores de aminoácidos aromáticos y más. Arco Pflügers. EUR. J. Physiol. 447, 619–628 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Hertz, L. & Dienel, GA Transporte y transportadores de lactato: principios generales y funciones funcionales en las células cerebrales. J. Neurosci. Res. 79, 11-18 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Casey, JR, Grinstein, S. y Orlowski, J. Sensores y reguladores del pH intracelular. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 11, 50–61 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Koveal, D., Díaz-García, CM & Yellen, G. Biosensores fluorescentes para el metabolismo neuronal y los desafíos de la cuantificación. actual. Opinión. Neurobiol. 63, 111-121 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bilan, DS & Belousov, VV Sondas genéticamente codificadas para monitorización de NAD+/NADH. Radical libre. Biol. Medicina. 100, 32–42 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Borden, PM y cols. Un sensor fluorescente rápido codificado genéticamente para una detección fiel de acetilcolina in vivo en ratones, peces, gusanos y moscas. http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/2020.02.07.939504 (2020) https://doi.org/10.1101/2020.02.07.939504.

Lobas, MA et al. Un sensor de longitud de onda única codificado genéticamente para obtener imágenes de ATP citosólico y de la superficie celular. Nat. Comunitario. 10, 711 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mendelsohn, BA et al. Una pantalla de alto rendimiento de los niveles de ATP en tiempo real en células individuales revela mecanismos de falla energética. PLoS Biol. 16, e2004624 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Cameron, WD y cols. Apollo-NADP(+): una familia espectralmente sintonizable de sensores genéticamente codificados para NADP. Nat. Métodos 13, 352–358 (2016).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Tao, R. y col. Los sensores fluorescentes codificados genéticamente revelan la regulación dinámica del metabolismo del NADPH. Nat. Métodos 14, 720–728 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yaginuma, H. y col. Diversidad en las concentraciones de ATP en una sola población de células bacterianas revelada mediante imágenes cuantitativas unicelulares. Ciencia. Rep. 4, 6522 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zapata-Hommer, O. & Griesbeck, O. Variantes plegables eficientemente y permutadas circularmente del mutante Zafiro de GFP. BMC Biotecnología. 3, 5 (2003).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Mongeon, R., Venkatachalam, V. y Yellen, G. Redox NADH-NAD(+) citosólico visualizado en cortes de cerebro mediante imágenes de biosensores de vida útil de fluorescencia de dos fotones. Antioxidante. Señal redox. 25, 553–563 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Looger, LL, Lalonde, S. y Frommer, WB Sensores FRET codificados genéticamente para visualizar metabolitos con resolución subcelular en células vivas. Fisiol vegetal. 138, 555–557 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dimmer, K.-S., Friedrich, B., Lang, F., Deitmer, JW & Bröer, S. El transportador de monocarboxilato de baja afinidad MCT4 está adaptado a la exportación de lactato en células altamente glicolíticas. Bioquímica J. 350, 219–227 (2000).

Artículo CAS Google Scholar

Kinney, JB, Murugan, A., Callan, CG y Cox, EC Uso de secuenciación profunda para caracterizar el mecanismo biofísico de una secuencia reguladora transcripcional. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. 107, 9158–9163 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nadler, DC, Morgan, S.-A., Flamholz, A., Kortright, KE y Savage, DF Construcción rápida de biosensores de metabolitos mediante perfiles de inserción de dominio. Nat. Comunitario. 7, 12266 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koberstein, JN, Stewart, ML, Mighell, TL, Smith, CB y Cohen, MS Un enfoque Sort-Seq para el desarrollo de biosensores de proteínas fluorescentes individuales. Química ACS. Biol. 16, 1709-1720 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yellen, G. & Mongeon, R. Imágenes cuantitativas de dos fotones de biosensores fluorescentes. actual. Opinión. Química. Biol. 27, 24-30 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andreoni, A., Davis, CMO y Tian, ​​L. Medición de la química cerebral mediante sensores fluorescentes codificados genéticamente. actual. Opinión. Biomédica. Ing. 12, 59–67 (2019).

Artículo de Google Scholar

Wang, H., Jing, M. & Li, Y. Iluminando el cerebro: sensores fluorescentes codificados genéticamente para obtener imágenes de neurotransmisores y neuromoduladores. actual. Opinión. Neurobiol. 50, 171-178 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Klein, AM y cols. Códigos de barras de gotas para transcriptómica unicelular aplicada a células madre embrionarias. Celda 161, 1187-1201 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Abate, AR, Chen, C.-H., Agresti, JJ y Weitz, DA Superación de las estadísticas de encapsulación de Poisson mediante ordenamiento cerrado. Chip de laboratorio 9, 2628–2631 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yasuda, R. et al. Activación supersensible de Ras en dendritas y espinas revelada mediante imágenes de vida útil de fluorescencia de dos fotones. Nat. Neurociencias. 9, 283–291 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M. & Weitz, DA Electrocoalescencia de gotas sincronizadas por flujo dependiente del tamaño en canales de microfluidos. Aplica. Física. Letón. 88, 264105 (2006).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Soep, B., Kellmann, A., Martin, M. y Lindqvist, L. Estudio de rendimientos cuánticos tripletes utilizando un láser de colorante sintonizable. Química. Física. Letón. 13, 241–244 (1972).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Díaz-García, CM, Nathwani, N., Martínez-François, JR & Yellen, G. Entrega de AAV para la expresión de biosensores fluorescentes en hipocampo de ratón juvenil. Bioprotocolo. 11, e4259 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Pologruto, TA, Sabatini, BL y Svoboda, K. ScanImage: software flexible para operar microscopios de escaneo láser. BioMed. Ing. En línea 2, 13 (2003).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Yellen y a M. Tantama y J. Markowitz por sus útiles debates y comentarios sobre el manuscrito, a M. Rahman, N. Nathwani y JR Martínez-François por su asistencia técnica experta, a M. Valenstein por su asistencia con FPLC y T. Kula y B. Powell por el acceso al fluorómetro. Agradecemos a la Instalación Central de Instrumentación de Investigación de Neurobiología de la Escuela de Medicina de Harvard y al Taller de Máquinas de Neurobiología (ambos apoyados por la subvención P30 EY012196 de los NIH) por su ayuda para construir las bombas de jeringa impresas en 3D. También agradecemos a J. Nainys por ayudar con el diseño de dispositivos de microfluidos personalizados (Droplet Genomics); y el Viral Core del Boston Children's Hospital y System Biology, NYU, Abu Dhabi, Emiratos Árabes Unidos (así como el Dr. Gordon Fishell) para el envasado de AAV. El biosensor Laconic fue un regalo de L. Felipe Barros (plásmido Addgene n.° 44238), y el sensor Lck-cpmTq2-Calcium-lifetime-sensor fue un regalo de Dorus Gadella (plásmido Addgene n.° 129627). Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01 GM124038 (para GY) y las becas NIH F31 CA254162 (para PCR), F32 NS116105 (para DJM) y F32 GM123577 (para DK).

Carlos Manlio Díaz-García

Dirección actual: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma, Oklahoma City, OK, EE. UU.

Yongcheng Wang

Dirección actual: Laboratorio Liangzhu, Centro Médico de la Universidad de Zhejiang, 1369 West Wenyi Road, Hangzhou, 311121, China

Li-Heng Cai

Dirección actual: Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Universidad de Virginia, Charlottesville, VA, EE. UU.

Peter J. Chou

Dirección actual: Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Departamento de Neurobiología, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Dorothy Koveal, Paul C. Rosen, Dylan J. Meyer, Carlos Manlio Díaz-García, Peter J. Chou & Gary Yellen

Departamento de Biología, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, MA, EE.UU.

Pablo C. Rosen

Departamento de Física y Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson, Universidad de Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Yongcheng Wang, Li-Heng Cai y David A. Weitz

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GY, DK, PJC, DAW y LH.C. conceptualizó el estudio. DK realizó los experimentos, analizó los datos y escribió el manuscrito. PCR, CMD-G. y DJM realizaron experimentos y contribuyeron a la redacción del manuscrito. DK, LH.C. y YW realizaron experimentos para establecer la viabilidad del proyecto. GY, DK, PCR y DJM adquirieron financiación. GY supervisó el estudio, escribió el software y redactó el manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Gary Yellen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Tommaso Patriarchi y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Koveal, D., Rosen, PC, Meyer, DJ y col. Una pantalla multiparamétrica de alto rendimiento para el desarrollo acelerado y la optimización de biosensores fluorescentes solubles codificados genéticamente. Nat Comuna 13, 2919 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30685-x

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Recibido: 23 de febrero de 2022

Aceptado: 11 de mayo de 2022

Publicado: 25 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30685-x

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